Способ получения ферментационного бульона

О П И С А Н И Е1959634ИЗЬБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К ПАТЕНТУ 1) Дополиительны 11 к патенту(31) 7119431 793274 (Опубликовано 15.09.82. Бюллетень Рй 34 ло делам иэовретеиий 5 З) УДКбб 3 18.09.8 ата опубликовани ИностранецВильям Чарльз Верн) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИОННОГОБУЛЬОНА Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения гидрофильногоколлоида (ксантовой смолы), являюцегося полисахаридом, который предназначен для вытеснения нефти из частичноистощенных скважин,Известен способ получения Ферментационного бульона, используемого дляполучения растворов для регулированияподвижности, применяемых при добыченефти, предусматривающий культивирование микроорганизмов Хап 1 Ьощопав сащрев 1 г 1 э в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, источники азота, фосфора, воду и другиенеобходимые микроэлементы 11.Недостатком данного способа является то, что для использования целевого продукта его необходимо подвергнуть Фильтрации или очистке от нераст.воримых веществ, влияющих на качественные и технические характеристикиферментационного бульона. 2Цель изобретения - обеспечение отсутствия в целевом продукте практически нерастворимых веществ, размеры которых превышают 3,0 мкм.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментационного бульона, используемого для получения растворов для регулирования подвижности, применяемых при добыче нефти, предусматривающему культивирование микроорганизмов ХапйЬопюпаэ савреэйг 1 э в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, источники азота, Фосфора, воду и. другие необходимые микроэлементы, в состав питательной среды дополнительно вводят лимонную кислоту, хелат кальция и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количествах соответственно равных 0,5-2,0; 0,02-0,07 и 0,0005-0,0025 г/л объема ферментируемой среды.Кроме того, в процессе культивирования в качестве вещества, способст. 3вующего образованию хелатных соединений, вводят этилендиаминтетрауксусную кислоту.После культивирования в фермента"ционный бульон вводят формальдегид вколичестве 0,2"10 г/л.фВ качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия.,Вода для приготовления питательнойсреды содержит менее чем 20 г/л каль" 10ция и других осаждающих в виде фосфатов катионов,После культивирования ферментационный бульон выдерживают в течение3-4 дней для получения бульона, прак 15тически свободного от нерастворимыхчастиц, превышающих размер 0,65 мкм.Средой для выращивания данного мик"роорганизма может быть бульон УИ(ОКсо) или среда, содержащая неочищенную глюкозу (церелозу), фосфатынатрия и калия, сульфат магния и любое органическое соединение, являющееся источником азота, например энзимнуюфвыварку соевых бобов или энзимную выварку казеина. После аэробно.го размножения в течение примерно30 ч при 25 ОС аликвоту бульона переносят в ферментер для осуществлениявторой стадии инокуляции.Предпочтительными углеводами являются глюкоза, мальтоза, фруктоза, отфильтрованный крахмал или их смеси.Предпочтительным источником азотаявляется неорганический нитрат: нитрат аммония, нитрат натрия и.нитрат35калия в заданных концентрациях. Магний, как один из необходимыхмикроэлементов, используют в видеМф 04 7 НО, или горькой соли, добавляя ее в концентрации до 1 г/л, наряду с наличием следов магния и железа. Веществом, способствующим образованию хелатов, является этилендиаминтетрауксусная кислота или, предпочтительно, лимонная кислота, котораяиспользуется в качестве реагента, спо"собствующего росту, а также пассиватора для кальция . В качестве буфера длясреды, обеспечивающего значение рН 5,95 О85, предпочтительно 6,0-7,5, вводятбольшое количество моно- и дифосфатов калия После аэробного размноже-.ния в течение 20-40 ч при 24-34 С,предпочтительно при 28-30 С, аликвоту 55раствора вносят в бродильный чан, со"держащий обеспечивающую получение вещества среду,4Эта среда подобна по составу среде, находящейся во второй стадии инокуляции, за исключением того, что вместо фосфатов калия предпочтительно используют фосфаты натрия (в связи с их низкой стоимостью) и малое количество кальция в форме солей, таких как хлористый кальций или нитрат кальция, или окислов, которые добавляют для увеличения выхода ксантана. Количество добавляемого кальция зависит от количества кальция, присутствующего в воде, используемой при приготовлении среды, используемого источника получения азота и видов и цепей используемого микроорганизма Хапйбощопаз Гсли вместе нитрата аммония исполвзуют нитрат .натрия или калия, требуется меньшее количество кальция (примерно 27 ч. на млн), Для получения среды можно использовать также деионизован 1 йую воду, дистиллированную воду- или 1 воду, содержащую менее 20 ч на млн, кальция и других осаждаемых при образовании фосфатов катионов, Ионы кальция можно добавлять в требуемой концентрации. Роль ионов кальция в обеспечении получения ксантата великано для предложенного способа наиболее существенным является предотвращение избыточного осаждения катионов кальция и других катионов в виде нерастворимых фосфатных солей. Это осуществляют путем добавления реагента, способствующего образованию хелатов, такого как этилендиаминтетрауксусная кислота.Важным параметром для обеспечения роста бактерий ХапйЬояопаз является рН среды. Предпочтительными значениями являются величины от 6,0 до 7,5. Регулирование рН в указанных пределах осуществляют использованием буферных соединений, таких как динатрийфосфат, Для предотвращения осаждения ионовфкальция, введенных в воду, в виде. нерастворимых солей кальция в буфер добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту. Предпочтительно регулировать рН в ходе цикла ферментации путем добавления растворов гидратов окиси натрия или калия, при использовании которых обеспечивается дополнительное преимущество, заключающееся в уменьшении вязкости бульона без уменьшения выхода ксантана и в отсутствии необходимости хелатации буферного раствора.Для быстрой ферментации необходимо точное количество кислорода, обеспе5 959634 6 чиваощее рост бактериальной культуры, , Растворы для регулирования подвижферментационную среду аэрируют с це- ности на основе завершенных Ферменталью обеспечения требуемого количест" ционных растворов, полученных в соотва кислорода для получения значения ветствии с предложенным способом, имесульфитного окисления, в пределах отют фильтрационные отношения которые1 1,5 до 3,5 ммоль кислорода на литр пригодны для большинства нефтеносных в минуту, Величина сульфитного окис- месторождений. Если проницаемость ления является мерой скорости кисло- подземных слоев очень низкая, то ис, рода на входе в бродильный чан при пользуют растворы для регулирования перемешивании и осуществлении аэрации 30 подвижности с малыми фильтрационнымиферментацию проводят при темпера- отношениями, причем целые или неочитуре около 30 С до тех пор, пока кон- щенные бульоны предпочтительно не должцентрация ксантана в бульоне не ста- ны иметь никаких нерастворимых веществнет по крайней мере 100 ч. на млн с размерами частиц, превышающими предпочтительно около 1 Ф и наиболее 1 з 0,65 мкм. Это можно осуществить прос- . предпочтительно около 1,4 Ф (30-96 ч). тым хранением готового ферментационно Вязкость раствора составляет обычно го бульона в присутствии формальдеги,000 сП, предпочтительно 7,000 сП. да в течение 3-4 дней. В процессе стаЖелательно убивать микробные клет- рения клетки ХапйЬоаопаз сжимаются ки путем добавления бактерицида. Пред-щ таким образом, что их размеры не препочтительным бактерицидом является вышают 0,65 мкм. Клетки имеют форму формальдегид в концентрации 0,2- стержня, причем обычно наибольший раз,2 г/л, который может быть добавлен мер по длине превышает 0,65 мкм, а на заключительной стадии Ферментации, меньший размер составляет 0,4-1,0 мкм до или во время хранения. 2 з Температура хранения некритична (ОПредложенный способ пригоден для 135 С, предпочтительно 20-45 оС). На работы со многими вариантами бактерий практике хранение при комнатной темпеХапОощопаз, Предпочтительным видом ратуре в течение длительного времени является ХапйЬопюпаз саюрезСг 1 з. осуществляется до тех пор, пока микро скопическое исследование не показываИспытание на фильтруемость явля- ет, что наименьший размер клеток не ется экспериментальной методикой, при превышает 0,65 мкм (через 3-4 дня),которой измеряется скорость протека- Иетодики испытаний, Готовят 1000 мл ния через фильтр, имеющий микропоры раствора, содержащего 750 ч. -на млн. размером 0,45-3,0 мкм, как функция ксантана в растворе соли с концентраот объема при постоянном давлении цией 500 ч. на млн 10:1 йаС 1-СаС 1)1 (2,82 кг/см ) . Фильтрационное отно- следующим образом.шение соответствует отношению периода В смесителе типа Варинга (Нагпц),времени, необходимого для собирания снабженном реостатом, замеряют коли- четвертых 250 мл раствора для регули-в чество бульона (основываясь на содер" рования подвижности, к времени, ко- . жании ксантана), необходимое для поторое необходимо для собирания первых лучения 0,75 г твердого ксантана.2505 мл этого раствора, фильтрационное Проводят разбавление от 1 до 6 раствоотношение, равное 1 свидетельствует , ром соли, Сдвигают смесь следующим обо том, что раствор не обладает тенден: разом: 40 мощности (2 мин 60, мощцией к забиванию. Допустимые значения ности) 2 мин, 803 мощности 2 мин.фильтрационных отношений для раство- Разбавляют раствор в смесителе до ров для регулирования подвижности со- концентрации ксантана 750 ч, на млн. ставляют 1-3 (микропористые фильтры с и сдвигают при МОЙ мощности в тече- размером пор 0,45-3 мкм), предпочти- ние 2 мин (раствор также используют30тельно1,7. для определения вязкости).Требуемые значения фильтрационных Используют экспериментальное устотношений и размеры пор фильтров, ис- ройство, которое позволяет определять пользуемых для испытаний конкретного скорость протекания через диск из микраствора.для регулирования подвижнос" ропористого фильтра (47 мм размерЯУ ти, зависят от проницаемости подзем" пор 0,46-8,0 мкм) как функцию от объных слоев нефтяного месторождения, ема при постоянном давлении в 28 н/м. для которого планируется вытеснение Резервуар емкостью 1 л заполняют нефти. 1 л ксантанового раствора (750 ч,1,00,69 1,0 7 95963 на млн.), создают давление 28 Н/м, открывают клапан и регистрируют объем фильтрата и время (с).Определяют фильтрационное отношение. бОпределение вязкости. Вязкость определяют с помощью синхроэлектрического вискозиметра Брукфильда (модель ЮТ с Ч-приставкой). Измерения ведут. при 25 оС и скоростях 6 и 12 об/мин, 1 о Вязкость выражают в сантипаузах.Определение содержания ксантана. Ксантан высокой степени очистки содер. жит около 18,М глюкуроновой кислоты. Количество глюкуроновой кислоты в ком 1 з позициях на основе ксантана определя- ют в отсутствие формальдегида и беэ бората при 1000 С по методу Кнутсона и Джинса,Содержание ксантана определяют по формулеГлюкуроновая кислота, Ф х 100 ,ф1 П р и м е р 1. Клетки ХапйЬопюпаэ сащреэСг 1 э из косого агара переносят2 в 300 мл бульона УМ, находящегося в 28-литровой колбе фернбаха, и встря. хйвают на вращающемся шейкере в течение 31 ч при 28 С. Аликвоту 25 мл переносят в колбу Фернбаха (2,8 л), Зв содержащую 500 мл среды следующего состава, г/л:Глюкоза-фруктоэа(Изосвит 100) 10,1Неочищенная глюкоза (церелоза) 25;1МН 4 МОЗ 1,0М 9504.7 НО 0,10Мп 504 НО 0,03Ге 504. 7 НО 0,01 40Безводная лимоннаякислотаКНРО 4КН Р .4 43Церелозу и Иэосвит 100 растворяют в дистиллированной воде и обрабатывают в автоклаве по отдельностиОстальные ингредиенты объединяют, доводят рН до 6,4.и также обрабатывают фф в автоклаве, Прошедшие раздельную об работку в автоклаве материалы затем объединяют вместе.После всряхивания при 28 С в течение 33 ч 200 мл раствора перемеща- фф ют в 4-литровый ородильный бак с механической мешалкой, содержащей 2 л среды следующего состава, г/л: 4 8Церелоза 25,7автоклавируют ю отдельности/ .Изосвит 100 10,1МН 4 МОЗ 1,0М 95047 НО 0,10Мп 504 НО 0,03Ге 50, 7 НО 0,10Безводная лимонная кислота 1,0СаС 1.2 НО 0,20МаНРО 4 3,34МанРО 4 0,70Сахара растворяют в 300 мл воды,обрабатывают в автоклаве по отдельности, остальные ингредиенты растворяютв 1700 мл воды, обрабатывают в автоклаве, после чего объединяют оба раствора. Затем проводят аэрацию с такойскоростью, чтобы обеспечить количество кислорода 1,5-3,5 ммоль/л в минуту.ферментацию проводят при 30 С вотечение 48 ч, при этом рН раствораподдерживают на уровне 5-7,5 добавлением буфера на основе фосфата натрия,разведенного в водопроводной воде.8 буфер на основе фосфата натрия добавляют также этилендиаминтетрауксусную кислоту для предотвращения осаждения фосфата кальция . В конце ферментации вязкость бульона 7800 сП (прискорости сдвига 6,27 сек-"), выходксантана 1,53.Раствор для регулирования подвижности имеет фильтрационнде отношение1,7 (микропористый фильтр с размеромпор 3 мкм),П р и м е р 2, Повторяют методикупримера 1 с использованием следующейферментационной среды, г/л:9596 44,2 4,53 14,2 317 Формула изобретения 9КНРО 4, 1КН,РО 4 069Среда,для получения продуктаО-глюкоза (обрабатываются в автоклаве %по отдельности) 27,00"фруктоза 3.,0Безводная лимонная кислота 1,ОМН 4 МО, 1,0М 9504 УНО 0,10Мп 504 Н 20 0,03ге 504 7 но 0 О 1СаС 1 2 нуО 0,20МатнР 043.34езМаНР 04 0,70Ферментацию осуществляют так же,как и в примере 1, за исключениемтого, что регулирование рН осуществляют раствордм гидрата окиси натрия 2 фбез одновременного добавления этилендиаминтетрауксусной кислоты.П р и м е р 3. Ферментацию в крупном масштабе осуществляют следующимобразом. ИСреда дляпосевного материала(МН 4)ЭРНОМ. 290КН, РО+М 9504, НО 0,5МЕ-амин УТ рН -7,0 11,0Среду вводят порциями по 500 мл,в две 2,8"литровые колбы фернбаха.После обработки в автоклаве и охлаждения колбы засевают клетками культурыХапЮопюпаз сашрез 1 гз. Послевстряхивания в течение 50 ч при 28 ОС содержимое обеих колб объединяют и используют для засевания бродильного чана емкостью 200 галлонов 757,08 л ),Посевная среда 2-я стадия ), г/л:.Церелоза 10,0(МН 4)НР 04, 2,0КНР 04 0,453Горькие соли 0,226М 7.-амин УТ рН -7,0 4,99ферментационную среду перемешиваютмеханической мешалкой, аэрируют дополучения 1,5-3,5 ммоль кислорода налитр в минуту, Через определеные проЯ,межутки времени добавляют раствор гидрата окиси натрия для поддержания рНна уровне 6,0-7,5.Для регулирования образования избыточной пены добавляют соевое масло,После проведения ферментации в течение 48 ч объем смеси. достаточный.длятого, чтобы получить 53 соотношение34объемов, переносят в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 800 галлонов (3028 л) среды следующего состава;Посевная среда (3-я стадия)(ЙН 4 МО (50-ный раст"вор), л 42,8КНРО кг 12,5КИР 04, кг 2,15Горькие соли, г 306М 9504 НО, г 94Ге 50.7 НО, г 30,5Церелоза кг 79,1(обрабатываютпо отдельностив автоклавеИзосвит 100, кг 31,75Безводная лимоннаякислота рН 7,0,кг 3,05После ферментации прй вышеупомянутых условиях в течение примерно 31 ч объем, достаточный для получения 103 соотношений объемов, переносят в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 1200 галлонов(обрабатываютсяв автоклаве по отдельности )Изосвит 100, лМН 4 МО (50-ныйраствор), л 7,57Гидратированный известняк, кг 0,33Безводная лимоннаякислота, кгМаНР 04, кгМан 2 Р 04, кгГорькие соли(М 9504.7 Н 20), г 454Н 9504 Н 10, г. 141Ге 504 7 НО рН "7,0 г 45,4Таким образом,.ферментационный бульон, полученный по известному способу, обеспечивает получение растворов для контроля подвижности с концентрацией 100-300 ч. на млн. коллоида ксантомонаса и не содержит нераство" римые вещества, имеющее размеры частиц, превышающие 3 мкм. 1. Способ получения ферментационного бульона, используемого для получения растворов для регулирования подвижности, применяемых при до11 "9596 быче нефти, предусматривающий культи" вирование микроорганизмов Хапйбоаопаз. саврезйгв в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, б источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения отсутствия в целевом продукте практически нерастворимых ве 0 ществ, размеры которых превышают 3,0 мкм, в состав питательной среды "дополнительно вводят лимонную кислоту, хелат кальция и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количест-, 15 вах соответственно равных 0,5-2;0;0,02"0,071 0,0005"0,0025 г/л объема ферментируемой среды.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в процессе куль тивирования в качестве вещества, способствующего образованию хелатных со. единений, вводят этилендиамидтетрауксусную кислоту.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и Й с я тем, что после культивиро 34 12вания в ферментационный бульон вводятформальдегид в количестве 0,2-10 г/л,4. Способ по и, 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве источника азота используют нитраты аммония, натрия и калия.5. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что вода для приготовления питательной среды содержит менеечем 20 г/л кальция. и других осаждающих в виде .фосфатов катионов.6. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после культивиро.вания ферментационный бульон выдерживают в течение 3-4 дней для получения бульона, практически свободногоот нерастворимых частиц, превышающихразмер 0,65 мкм.Приоритет по пунктам:05,08.76 по пп. 2-5,03 05.77 по пп. 1, 6,Источники информации, .принятые во внимание при экспертизе1. Патент США Мф 3427226,кл. 195-31, опублик. 1969.Составитель И, Привалова Редактор Л. Веселовская Техреду С.Мигунова Корректор Г. Решетник Заказ 7039/79 Тираж 505 , Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва Ж;35 Раушская наб. а, 4/5