Способ получения антибиотика сс-1065

ИностранцыЛадислав Джеймс Ханка и Дейвид Гленн Мартин(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУ 1 ЕНИЯ АН 1 ИБИО 1 ИКА ССИзобретение относится к микробиологической промышленности и касаетсяполучения антибиотиков.Цель изобретения - получение но 5вого антибиотика.Эта цель достигается тем, чтоштамм 5 герсовусеь 2 е 1 елз 1 в ЙВКЬ11,183 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода иазота, в аэробных условиях, отделяютмицелий от культуральной жидкости,далее мицелий экстрагируют ацетоном,полученный экстракт концентрируют,объединяют с отделенной культуральнойжидкостью и полученную смесь многократно экстрагируют хлористым метиленом.Штамм 5 сгерт.оеусеь ие 1 ель 1 в МКЙЬ11,183 для производства антибиотикаССвыделен из почвы и хранитсяв коллекции культур йогеЬегп йе 91 о-ла 1 йезеагсЬ 1.аЬогаогу, О,5. Оерагй"вела о адг 1 сн 1 йоге Реог 1 а 5111 ло 1 ь13,5,А под номером ММ 1 11,183,Штамм представляет собой культурусеро-зеленого цвета, имет круглыеспоры, образующие короткие цепи следующих форм: от прямой до открытой спиральной до спиральной, поверхностьколючая или тернистая. Пептонная среда с железом. Поверхность бледно-серо Зеленая, обратная сторона рьпкего цвета. Пигмент рыжего цвета, меланин-отрицательная реакция,Глюкозо-аспарагиновый агар, поверхность бледно-серо"зеленого цвета,обратная сторона бледного цвета. Пигмент не образует.Тирозиновый агар. Поверхность зелено-серая, обратная сторона - коричневый цвет. Пигмент светло-коричневый,Питательный крахмал. Поверхность зелено-серая, обратная желто-зелено-рыжая. Пигмент светло-рыжий, гидролизуеткрахмал.Дрожжевой .экстракт с солодом, Поверхность зеленого цвета, обратнаясторона рыжая. Образует пигмент рыжего цвета.Снятое молоко. Поверхность чутьбледная серо-розовая. Обратная сторона оранжево-рыжая. Образует пигмент ор нжево-рыжего цвета.Пептонно-дрожжевой экстракт сжелезом. Поверхность бледно-серобелая, Обратная сторона рыжая. Пигмент рыжего цвета,Физиологические признаки. Штаммхорошо растет на ксилозе, фруктозегалактозе, глюкозе, маннозе, мальтозе,целлооиозе, декстрине, растворимомкрахмале, глицерине, манниге и инозите. Слабо растет на арабинозе, оксалате натрия, ацетате натрия и сукцинате натрия. Плохо - на рамнозе, сахарозе, лактозе, рацинозе, инулине,5дульците, сорбите, салицине, феноле,цитрате натрия, Формиате натрия, тартрате натрия и салицилате натрия.культура слабо растет при 4 Сс, оумеренно при 18, 24 и 45 С хорошорастет при 28, 32 и 37 оС. При 55 ОСроста не наблюдается.Предложенный антибиотик получаютпутем выращивания организма В воднойпитательной среде в погруженных аэробных условиях. Для выращивания можноиспользовать поверхностные культурыи колбы-бутыли. Организм выращиваютВ питательной среде, содержащий источник углерода, например ассимилирующийся углеводород, и источник азота, например ассимилирующееся соединение азота или белковое вещество.К предпочтительным углеродным источникам относятся глюкоза, желтый сахар, Ясахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал, лактозадекстрин,черные патоки и т.п. К предпочтительным источникам азота относятся жидкость от отстоя кукурузы дрожжи, Зравтолизованные пивные дрожжи с твердыми молочными продуктами, соевуюмуку, муку семян хлопчатника, кукурузную муку, твердые молочные продукты, панкреатический продукт пи- З 5 щеварения казеина, рыбную муку, твердые продукты от перегонки, животныепептоновые жидкости, мелкие мясныеи костные остатки и т.п. Микроколичества металлов, как цинк, магний, марганец, кобальт, железо и т.п., добавлять в Ферментационную среду не нужно, поскольку перед стерилизацией последней в качестве компонентов применяют водопрсзодную воду и неочищенные ингредиенты. 45Выращивание осуществляют при любой температуре, обеспечивающей удовлетворительный рост микроорганизма, например в диапазоне примерно 18- 40 ОС, предпочтительно примерно 20- 28 ОС. Обыкновенно оптимального количества антибиотик достигает в течение примерно через 3-15 дней. Среда обычно остается в течение ферментационного процесса щелочной. Конечный рН зависит частично от присутствующего буфера, если таковой применяется, и частично От начального рН культуральной среды.Если выращивание производят в больших сосудах или баках, целесооб разно применять вегетативную, а не споровую форму микроорганизма при :инокуляции во избежание заметной задержки при производстве антибиотика и связанного с этим неэффективного 65 испОльзОВания ОбОруДОВаниЯЖелатель -но получение Вегетативного прививочного материала В питательной бульонной культуре путем инокуляции этой бульонной культуры аликвотным количеством почвы, жидкой 1-агаровой среды или же разводкой на косой среде. По обеспечении такого молодого активного вегетативного прививочного материала его стерильно помещают в большие сосуды или баки.При выделении и очистке антибиотика, получаемого предлагаемым способом из Ферментационного пива, может найти применение целый ряд способов, Выделение осуществляют экстрагированием с помощью растворителей, как хлористый метилен, ацетон, бута- нол, этилацетат и т.п. для очистки сырых препаратов антибйотика применяют хроматографию на силикагеле.Согласно предпочтительному варианту процесса Выделения антибиотик выделяют из культуральной среды разделением мицелия и нерастворенного твердого продукта обычными способами, например фильтрацией или центрифугированием и экстракцией растворителеммицелиевого жмыха и ставшего прозрачным бульона. Иицелиевый жмых экстрагируют ацетоном, а экстракт Выпаривают при пониженном давлении до водного концентрата, Водный концентратдобавляют в фильтрованный бульон, который затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена.Соединенные экстракты Выпаривают при пониженном давлении, полученное масло разбавляют скеллизольвом Визомерные гексаны) . Полученную взвесьохлаждают в течение ночи, после чегосОбирают твердый продукт прОмыВают скеллизольвом В и сушат, получая относительно сырой препарат(желто-коричневый твердый продуктантибиотика СС.Полученный сырой препарат антибиотика подвергают очистке, получая существенно чистый кристаллическийпрепарат антибиотика СС. Первойочистной ступенью является экстракциясырого препарата антибиотика ССацетоном. После выпарки ацетона полученный остаток растирают с метанолом, получая кристаллический препарат антибиотика СС, Эти кристаллы можно промыть холодным метаноломс целью повышения степени их чистоты.Дальнейшую очистку антибиотика ССосуществляют путем хроматографии на силикагеле с кристаллизацией активных Фракций. Препарат антибиотика ССцелевой степени чистоты получают перекристаллизациейвышеприведенного антибиотика ССпрепарата из ацетона метанола.Активные фракции от хроматографии на силикагеле определяют тонкослойной хроматографией-биоавтографией55 Согласно этому способу 1 мк обраэцапробы антибиотика помещают в виде капли на силикагель Ва 1 сег 11 ех а 111 са де 1 1 В-Г и биоавтографируют на организме Вас 111 ца ацЬЙ 111 а (синтетическая среда)или же 5 агспа 1 цгеа после проявления в растворе, состоящем из 90 ч хлороформа, 10 ч метанола и 0,5 ч концентрированной гидроокиси аммония. ТСХ-зона антибиотика ССот 1 мк или более высоких количеств кристаллического образца-пробы также можно визуализировать с помощью Уф-света (254 нм) в виде эоны янтарного света прн обычном свете.П р и м е р. Ферментация.Для инокуляции крлб Эрленмейера 15 емкостью в 500 мл со 100 мл стерильной среды, содержащей вес.ЪЭкстракт дрожжевой 0.,3Бакто-триптон 0,5Декстрин 0,1 20 используют штамм 5 сгерососсца Ее 1 епа 1 ь ИВКОВ 11,183.Эту среду инкубируют при 28 ОС в течение 48 ч на ротационном вибра" торе типа Сцпр гоСагц азасег при 250 об./мин.Прививочный материал применяют для инокуляцни колб Эрленмейера емкостью 500 мл для ферментации, со 100 мл стерильной ферментационной среда, содержащей вес.В:Черная патока 1Декстрин гБакто-триптон 1/СаСО 0,5Хлористый натрий 0,2, 35Значение рН,2. Ферментационные колбы инокулируют при концентрации 5 мл прививочного материала на. 100 мл ферментационной среды. Колбы инкубируют 120 ч при 28 оС на ротационном40 вибраторе типа ВАРИАН при 250 об/мин,Испытание антибиотика ССзавершается экстракцией исчерпанной питательной среды с применением двух объемов хлористого метилена. Разные количества метиленхлоридного экстракта (20,10,5, 2 и 1 мкн) наносят на полиграммные силикагельные листы типа Ро 1 удгав 511 - Л 1-НВ и биоавтографируют на 5 агс 1 па 1 цсеа после проявле-ния в системе растворителей, содержащих, мл:Метиловый спирт 10ХлороФорм 90Гидроокись аммония 0,5 для этого 125 мл охлажденного до 48 С агара инокулируют оттаянной бульонной культурой 5 агс 1 па 1 цйеа (0,5 мл/л), выливая затем в пластмассовые сосуды и давая отвердитель Агаровые сосуды инкубируют при 32 С щО в течение 20-24 ч.Прививочиый материал 5 агс 1 па 1 цг.еа, содержащий 10 с клеток/мл хранят в качестве .аликвоты в газовой фазе жидкого азота. 65 Выделение антибиотика, Полученный ферментационный бульон от 4-форментационных процессов в баках по 10 л каждый фильтруют через слой Се 1 аоп ЕЯ 40(диатомовая земля 1 г. Мицелиевый жмых экстрагируют ацетоном экстракт выпаривают под пониженным давлением. В прозрачный бульон добавляют водный концентрат, полученный выше, затем трижды экстрагируют половиной объема хлористого метилена. Мвткленхлоридные экстракты выпаривают под пониженным давлением до масла, которое разбавляют скеллнэольвом В (1,5 л), после чего полученную взвесь охлаждают в течение ночи. Затем твердый продукт собирают, промывают снеллизольвом В и сушат, получая сравнительно сырой препарат антибиотика ССв виде желто"коричневого твердого продукта. Этот сырой препарат можно подвергнуть биоиспытанию тонкослойной хроматографией -биоавтографией, как описано выше.Очистка. Сырой препарат антибиотика ССэкстрагируют ацетоном (400-800 мл) в целях удаления небольших количеств нерастворимых в ацетоне продуктов. Ацетон выпаривают, остаток растирают с метанолом (10 мл/мг). Взвесь охлаждают в течение ночи, полученный твердый кристаллический продукт собирают, промывают холодным метанолом и сушат, выход 40-180 мг кристаллического препарата антибиотика СС. Этот кристаллический препарат подвергают биоиспытанию путем ТСХ-биоавтографии на силикагеле.Дальнейшую очистку осуществляют хроматографией на силикагеле и кристаллизацией активных фракций. Так, например, 470 мг этого кристаллического твердого продукта растворяют в 940 мл ацетона и выпаривают на 10 мл силикагеля Седцгап ТЛ 15160.Полученный порошок хроматографируют на 100 мл силикагеля, элюируя растворителем, состоящим из 80 ч хлороформа, 20 ч метанола и 4 . гидро- окиси аммония. 20 фракций(по 20 мл каждая)собирают и выпаривают досуха. Фракции затем подвергают биоиспытанию посредством ТСХ-биоавтографии. Фракции 6-19 помещают в емкость и растирают с метанолом, получая 218 мг высококачественного кристаллического антибиотика СС, Целевой степени чистоты можно достичь перекристаллизацией из ацетона-метанола, получая 167 г (77%) в основном чистых кристаллов антибиотика СС.Мо- кулярный вес антибиотика ССприблизительно 700, элементный анализ С 61,06; Н 4,92,Л 13,17.УФ-спектр поглощения. Раствор антибиотика ССв диоксане показы" вает сильное концевое поглощение с плечами при 230 нм(способность пог797591 15Прививаемые организмы - получен"ные за ночь культуры испытуемых ор"ганиэмов, разбавленных таким образомчтобы конечная популяция содержалаприблизительно 105 клеток/мл. Трубки 20 инкубируют на 42 ч при 28-37 сС. МИКопределяют переносом 0,1 мл бульонаиз тех трубок, которые не показываютразвития в 10 мл не содержащего антибиотика бульона, трубки, в котбрыхза 24 ч не наблюдается роста культуры7,рассматриваются как содержащие бактерицидные концентрации. Бульон длягрибов содержит,Ъ:КНп РО 4 0,5Декстроэа 3,0Дрожжевойэкстракт 0,7. и 001 0,00,003 5 йарЬ 11 ососсцзаогець ОС 705 йарЬу 1 ососсцз аогець ОС 3665,5 лощения а=68,00) и 258 нма=51,10 и максимум при 364 нм а=66,10) .ИК-спектр поглощения. Антибиотик ССпоказывает характерный ИК- спектр поглощения в пасте на основе мичерального масла в диапазоне волн 3800-600 см 1.Пики наблюдаются при следующих диапазонах волн, бм : 2960, 2920, 2850, 1465 и 1377 , частично они зависят от алифатических С-Н колебаний минерального масла.Растворимость. Антибиотик ССрастворим в таких. растворителях, как дийетил-сульфоксидДМСО, диметилформамид, ацетон, хлористый метилен, этилацетат, дйоксан и хлороформ.8 С-ЯМР-спектр антибиотика СС"1065 при 20 МГц найден на спектрометре Чаг 1 ап СРТв растворе(около 1,0 мл, около 75 мг/мп)образца-пробы антибиотика ССв дейтеро"диметилсульфоксиде. Спектр калибруют против центральной линии дб ДМСО,.помеченной 39,6 ч/мл(частей ва миллион в пересчете на тетраметилсилан, принимаемый за 0 ч/мл. Частоты регистрируют вниз от тетраметилсилана,Протонно-магнитный резонансный спектр( н-ЯИР)антибиотика сспрн 100 МГц наблюдают на спектрометре тйпа Чаг 1 ап Х 1. 100-15 в растворе (около 0,5 мя, около 150 мг/мл)об- разца-пробы антибиотика СС"1065 в р5 йарйу 1 ососсцв ао геок О арЬу 1 ососсцв аогец ОС 55 дейтеро-диметилсульфоксиде (дб ДМСО), Спектр калибруют против внутреннего тетраметилсилана, частоты регистрируют в ч/мин, вниз от тетраметилсилана,Противомикробный спектр антибиотика СС. Антибиотик ССдействует против различных грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий и грибов, как видно иэ таблицы.Опыты проводят следующим образом.Минимальную ингибирующую концентрацию(МИК) определяют стандартными бактерицидными способами с применением двукратно разбавленных растворов антибиотика в бульоне Вга 1 п Неагй.797591 10 Продолжение таблицы КеЬь 1 е 11 а рпецвоп 1 ае ОС 57 5 а 1 аопе 11 а эсЬоСпце 11 ег 1 ОС 126 5 ащопе 11 а рц 11 огце ОС 267 0,8 0,3 0,08 Гцп 91: Сапд 1 да а 1 Ь 1 са,пэ ОС 1392 5 ассЬаговусеэ сегеп 1 ь 1 ае ОС 1337 0,04 5 ассЬаговусеь раэйог 1 апцэ ОС 1342Реп 1 с 1111 ца оха 11 сце ОС 1268 0,3 0,2 Формула изобретения Составитель С. .алютинаРедактор С. Лыжова Техред И.Асталош Кор ектор В. СиницкаяЗаказ 9825/82 Тираж 539 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиап ПП "Патент",г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Антибиотик ССтакже оказывает действие против опухолевых клеток1210, развивающихся в культуре(в пробирке). На живом организме мышей антибиотик ССтакхе ингибирует лейкемию 1 1210, лейкемию Р 388и меланому В 16,Антибиотик ССоказывает действие против грамм-положительных бактерий, например против Ргоссць чц 19 аг 1 э, и тем самым может найти применение в качестве маслоконсервирующего средства в целях ингибирования действия этой бактерии, вызывающей порчумасла(растительного) . Он также полезен в промывных растворах в областисанитарии. Поскольку антибиотикССоказывает действие противВас 111 ц ьцЬ 111 ь его можно применятьдля обработки мест размножения тутового шелкопряда в целях предупрежде. ния или же минимализации заражений,вызываемых, как известно, этой бактерией.Предложенный способ позволяет получить новый антибиотик, который найдет применение в народном хозяйстве. Способ получения антибиотика, о тл и ч .а ю щ и й с я тем, что штамм 5 сгер 1 ощусеэ ке 1 епэ 1 э НВРЬ 11,183 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в аэробных условиях, отделяют мицелий от культуральной жидкости, далее мицелий экстрагируют ацетоном, полученный экстракт концентрируют, объединяют с отделенной культуральной жидкостью и полученную смесь многократно экстрагируют хлористым метиленом.Г