Способ определения содержания лизоцима

(19) 12 10 ин ко а Огюпииеслоя люююосгпьУ,Р О УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ЫТИЙ(71) Центральный ордена Ленинаинститут усовершенствования врачей(56) 1. Каграманова К.А., Ермольева З.В, Сравнительная характеристикметодов определения активности лицима. -"Антибиотики", 1966, к 10,с. 97-919 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖА НИЯ ЛИЗОЦИМА путем инкубации биоло гической жидкости с клеточными стен ками Мхсгососсов 1 увойеИдсцв, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа повышения его чувствительности и точности,кубацию проводят 10-15 мин при мнатной температуре, добавляют раствор 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода, затем прибавл ют раствор пероксидазы и спектрофотометрируют.1143Изобретение относится к экспериментальной медицине и может бытьиспользовано для определения содер"жания лизоцима в биологических жидкостях, тканях и молоке, в клинической и экспериментальной медицине,в медицинской и молочной промышленности,Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому результату является способопределения содержания лизоцима,который заключается в том, что субстрат клеточных стенок Мдсгососсцв1 увойеЖг.1 сцв добавляют к агаруВЫсо". Сыворотку или другую биологическую жидкость вносят в лункиагара. Чашки инкубируют в термостатепри 37 С в течение 20 ч, Содержаниелизоцима определяют путем сравнениядиаметров зон лизиса субстрата исследуемыми образцами и стандартнымирастворами лизоцима. Концентрациюлизоцима вычисляют по стандартнойполулогарифмической кривой. 25Однако известный способ являетсядлительным и трудоемким (требует приготовления агаровой среды с субстратом), мало чувствителен, так какзависит от диффузии лизоцима в агар, ЗОи частичного его связывания агаровымгелем. Кроме того, способ являетсянедостаточно точным, так как полученные результаты оцениваются визуально путем измерения зон задержки35роста тест микроба,Цель изобретения - ускорениеспособа, повышение его чувствительности и точности,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения содержания лизоцима путем инкубации биологической жидкости с клеточными стенками Мсгососсцв 1 увойеЖг 1 сцв, инкубацию проводят 10-15 минпри комнатной температуре, добавляютраствор 5-аминосалициловой кислотыи перекиси водорода, затем прибавляют раствор пероксидазы и спектрофотометрируют.Способ осуществляется следующимобразом.Определение лизоцима в исследуемойбиологической жидкости начинают с построения стандартной кривой. Для 5 этого лизоцим титруют в 0,5 мл физиологического раствора начиная с 5000 до 38 нг/млИз полученных разведе 778 3ний лизоцима отбирают по 0,1 мл и переносят в два параллельных ряда большого пластикового планшета для микроагглютинации. Взвесь стенок М 1 сгососсцв 1 увойе 1 кс 1 сцв с концент- рацией 1 мг/мл готовят перед исследованием и после тщательного растирания в физиологическом растворе добавляют по 0,05 мл к разведениям лизоцима. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 10-15 мин, после чего к реакционной смеси добавляют по 0,5 мл субстрата на пероксидазу (0,087-ный раствор 5-аминосалициловой кислоты с 0,057- ным раствором перекиси водорода (5-АС НО ) в соотношении 9:1), Через 2-3 мин инкубации к полученной смеси добавляют 0,05 мл 0,047-ного раствора пероксидазы. В контроле светложелтый раствор субстуата 5-АСх хНО после взаимодействия с пероксидазой через 15-20 мин становится темнокоричневого цвета. В процессе взаимодействия лизоцима с клеточными стенками М 1 сгососсцв 1 увос 1 едкс 1 сцв выделяется продукт разрушения, который является конкурентным восстановителем перекиси водорода, входящей в другую фермент-субстратную систему (пероксида- за - 5-АС х Н 20 ) . В результате такого конкурентного восстановления перекиси водорода степень срабатывания второго субстрата (5-АС х НО) зависит от количества продуктов разрушения стенок Мдсгососсцв 1 уводе 1 кг 1 сцв, которое пропорционально количеству определяемого лизоцима. По мере уменьшения концентрации лизоцима происходит нарастание интенсивности окрашивания конечных продуктов реакции, которые через 15-20 мин регистрируются спектрофотометрически при 450 нм. На основании полученных данных строят калибровочную стандартную кривую лизоцима, откладывая на оси абсцисс концентрацию лизоцима в нг/мл, а на оси ординат - оптическую плотность растворов.На чертеже представлена калибровочная кривая.П р и м е р. Определение содержаниялизоцима начинают с разведения сыворотки физиологическим раствором в соотношении 1: 10, В лунки пластикового планшета вносят по 0,1 мл разведенной сыворотки и добавляют по 0,05 мл взвеси тщательно растертых в физиологическомПредлагаемый способ Метод диффузии в агар Исследуемыеобразцы Время Содержаниелизоцима, нг/мл Содержаниелизоцима,мкг/мл Времяпроведения испытаний, ч проведения испытаний,мин Сыворотка крови 45-60 5000 4,8 20-22 3150 3,0 1000 0,8 2600 2,5 4150 3,8 7,5 8000 1550 1,5 3150 3,0 9 лимфа 6250 6,0 4200 4,0 3 1143 растворе стенок М 1.сгососсцз 1.узойе 1 сйсиз в концентрации 1 мг/мл. После 10-15 мин инкубации при комнатной температуре к реакционной смеси добавляют 0,5 мл субстрата на пероксидазу: 0,083-ный раствор 5-АС с 0,052-ным раствором перекиси водорода в соотношении 9:1 и через 2-3 мин 0,05 мл 0,047.-ного раствора пероксидаэы. Интенсивность окрашивания 10 конечных продуктов через 15-20 мин измеряют спектрофотометрически при 450 нм. Концентрацию лизоцима в сыворотке находят по стандартной кривой. Найденную концентрацию 15 умножают на степень разведения и получают содержание лиэоцима в нг/мл. Оптическая плотность исследуемой сыворотки равна 0,3. По стандартной ,кривой находят, что это соответству ет 830 нг/мл лизоцима. Полученную концентрацию умножают на разведение (10) и находят содержание лизоцима в испытуемой сыворотке, которое равно ,8300 нг/мл или 8,3 мкг/мл.25В таблице приведены результаты опытов по определению содержания лиэоцима в биологических жидкостях 778 4и тканях предлагаемым способом и известным - методом диффузии в агар.Результаты этих исследований показывают явное преимущество предлагаемого,способа по сравнению с известным. Об эффективности предлагаемого способа свидетельствует и его более высокая чувствительность, позволяющая выявить наличие лизоцима в образцах, которое базовым способом не улавливается.Таким образом, предлагаемый способ является экспресс-методом, так как позволяет провести определение содержания лиэоцима в испытуемых образцах в течение 45-60 мин, в то время как известным способом - на протяжении 20-22 ч. Предлагаемый способ по сравнению с известным в 10-20 раз чувствительнее, так как позволяет определить содержание лиэоцима в нг/мл по сравнению с мкг/мл известным способом. Кроме того, предлагаемый способ позволяет проводить быструю и точную инструментальную оценку реакции, что особенноважно в практике клинико-диагностических лабораторий.Предлагаемый способ Исследуемыеобразцы н могенаты орган 5 5-60 9500 7 62 олок 45-6-22 1 пастеризованное л 4 0 ативное 70 4 пастеризованно 6 леды ативное П Исслед животн ч ия проводят, используя сыворотки человека гомогенаты тканей животных. цола Техред А.Бабинец Корректор И.Эрдеи да 3 Н Тираж 525 ИИПИ Государств о делам изобре Москва, Ж,аказ Подпнсноомитета СССРоткрытийнаб., д.4/5 нногений 130 ушска Патент Ужгород, ул.Проектная,4 ил Содержаниелизоцима,нгlмл Времяпроведения испытаний,Содержанилйзоцима,мкгlмл ремяроведеия испыаний, ч