Способ определения глюкозы в биологических жидкостях

.09,83 Бюл. Н 32иномведьсерараг о, ТамаГабри елла088.8)Р. - Лпп С 1 0.08.8 еанал еренц ароци 16.07 г 1 пг 1 ег 6. 24. яр (НЦ)Янчо,йка (Н 13) 1 п. В 1 осЬеш ГЛЮКОЗЫ ОБ ОПРГДЕЛЕНИЯ СКИХ ЖИДКОСТЯХ ретение относи тности к клини ретения - новь а счет стабили(54) СПО БИОЛОГИЧ (57) Изо не, в ча Цель изо способа ся к медициеской химии. ение точност ции окраски я стаб я носится к медициненической химии,ния лвляется поИзобретение о н частности к кли Целью изобрет вышение точностиособа за счет ст ионнои смеси окраски неакп 1 поивечен г бил из а пиНа Ф т.обом п вой пои к оаФикхарак лицейньп 1ении копц ер крика ации гл гзм кваски с и с ными методами Способ осущ едую тнляю азом, Способ осг м чт го ве ес на для об исполь то ппи ества г кпаслшами нефеных чсл а зова ниовать азон и тим иях е тим ГОСУДРРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЭО,801505444 А 5 реакционной смеси. Для этого в раствор буферного вещества добавляют глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминофеназон и азид натрия. Параллельноготовят вещество, взаимодействующеес 4-аминофеназоном, - тимол, . растворенный в зтаноле. Затем оба растворасмешивают н соотношении 4:1 фсоотнетственно. Реактив добавляют в биологическую жидкость и инкубируют смесь,а затем ее спектрофотометрируют.Способ позволяет с высокои чувствительностью + 0,17 ммоль/л (по отношению к глюкозе), точностью +0,09 ммоль/л(по отношению к глюкозе) и невысокойпогрешностью+ 0,357 (по отношениюк глюкозе) определять концентрациюглюкозы в биологических жидкостях. место хопошо неализчема ( ильна линейная хапактеоистика, неччвстнительность к свету) фотометрическая реакция с высокой чувствительностью.Согласно предпочтительному вариан ту способа тимол растворяют в низ - шем спирте, предпочтительно в этаноле; другие химические вещества растворяют в дистиллиронаннои воде, аспиртовой и водный растворы смешивают друг с другом в соотношении1:4. Полученный таким образом реактив содержит тимол в концентрации2, 5+ О, 2 ммол ь/и,Концентрация других химическвеществ в реактиве следующая:1505444 0,8+0,2Коцецтрдции 4-дмицоФецаэоца приводятся в табл., Измерения в этом2,50случае также призводят с растворомглюкозы и раствором тцмола концентрацией 2,5 ммоль/л,Согласиданным табл.2, максмдль 55цая, больше ие излецяющаяся экстинкция плу ветел при концентрации 4-дло цсфе паз с ца О, 600 ммоль/л. Длябльлнй цдгежцости в качестве птпФос;тн буФер,лог ь/л 0,08 фО, 024-А ми цофе цд з он,ммо.ь/иАзии цдтрил,ммол ь/л 9.85+0 1Этдцг, ммоль/л 330.0+20Тилол и 4-амицоФецазоц соединяютс определяемьми субстацциями в цеобходимых коццецтрациях в буФерном веществе. В результате вследствие специФических Фермецтдтивцых реакций образуется перекись водорода, Из образуащейся перекиси водорода освобождается с помощьо пероксидазы кислород,который образует 4-(2 -изпропил-лети,А -бецзохицоцмоцоимицо)-федзоц (т.е. красящее вещество).1 р едлагдемый способ отличается тем 20)чтцветная редкция происходит в определенной рН-области (рН 7,0-8,0,предпчтительцо 7,5), максимум поглэшепл света полученцого краслщего вещества пдддет цд волновой диапазоц 25465-480 нм, поэтому целесообразнофоз мегри осипе измереция проводитьв этом ддсдзоце в частности цд волне 475 цм. Осс)сяпо важно, что опреде)се. Фотом . грически цвет обрдзуетсл срдвцтельцо быстро. Установлецо, чт стабильцый цвет при комситной температуре появляется в теочепе 25 миц, а при 37 С - через15 лсиц. /1) Устдцовлецл оптимальцо 35эа геяя рН могут быть использовацыразличные буФеры (трис-Фосфат,И, НРО Ы 1 Рс ) 1, НГО КНГО иборат натрия - НС 1).1 дстворлть тимол необходимо в глетдцоле, этацоле (предпочтительцо) илиизопрспое, Коццецтрации тимолаприведены в табл. 1.Очевидно, что в случае двух растВоров Глахэы пдивысшая болые е 45возрдстдющал экстинкция (интецсив-ность окрдски) по.учается при коццецтрдции тило)д 2, 5 ммоль/л,лс. ый при лил 1 ется коппс.итра ци 5 О, Я)О ллсгь/.Концентрация перекиси, требуемая для излереция г;юкозы, также сптимиэ р уст си (см. табл . 3), Оптимал ьцой лнляетсл концецтрацпя 1 Е/мч (1:.; - межд, цародцая единица - количество, которое заменяет 1 мм:ь суб:трата в течецие 1 миц) . Использование пероксидаза не ложет содержать другие Фермецтцые рилеси в концентрациях, оказывающих вредцое воздействие.Из табл. 3 видно, что максимальная интенсивность (экстинкция) полученного с глюкозой цвета достигается уже при ферментцой активности 14:Е/мп; для большей надежности берется активност. 1 Е/лц.1 ри опрея зле ии холестерица примецяетсл дстергецт, чтобы повысить рдс гвормос:ть. С этой целью может быть использован 9-лаурпгэ 1 ирполиеканол (Сигма, СШ.), Тритоц Хок гилФецолп сли э тип енгликол ьэфир, ОВЛ, Австрия) или Бридж 35 (полиоксиэтилецлаурилэФир, ВЕ, Англия). Дагазов оптплдьцых концентраций вьшеуказаццгх веществ составляет 0,4 - 1,2/.П; и м е р 1, Определение глюкь в сыворотке крови.Раствор А. В 0,1 моль/л раствора Фос 1 дтцого буФера (рН 7,5; Иа НРО 4.2 Н О и КНРО 4) растворяют следующие вещества; 1 покозооксидазд, Е/мл 12,5 11 ероксидаза, Е/мл 18,0 АминоФецазоц, ммол ь/л 10,0 Лзид цатрия, ммол ь/л 12,3 Раствор В. 12.5 ммоль/л тимола в 96,),-л этдноле (с дистиллировацной водой),Реактив приготовляют путем смешиация растворов А и В в соотношении 4:1.Стандартизация производится с помощью 11,1 ммоль/л раствора глюкозы (н цасыщецс й без цагревдция бецэойцой кислоте).В пробирных трубочках уравновешинаот по 3,0 мл реактива, 0,02 лп стдцдартд и в других трубочках 0,02 мп сыворотки крови, Вещества перемешигаат и выдсрживают при комнатной тем5 1505444 пературс 30 мин или при 37 С 15 мин. В последнем случае цвет, образовавшийся после 10-минутного охлаждения7 фотометри вски сравнивают с холостым опытом (толщина кюветы 1 см, длина волны 45 нм) .Концентрация )сыворотки крови (в глюкозе, ммоль/л) рассчитывают по следующей формуле: 12000 0,8 8000 12,32,5 150002,5 12000 12,3 2,5 Экстинкция пробы11 ф 1Стандартная экстинкция 15Процесс характеризуется линейностью в диапазоне 0-30 ммоль/л..П р и м е р 2. Для определениясодержания глюкозы в сыворотке кровиприменяют реакционный раствор следующего состава:Фосфатный буфермоль/л 0,09Глюкоэооксидаза,ИЕ/л 25Пероксидаза,ИЕ/л 15000Ти молммол ь/л 2,54-Аминофеназон,ммоль/л 0,8 30Азид натрия,ммоль/лЭтанол. моль/лДетергент(Вг 13-35), % 2,5Значение рН реакционного раство 35ра составляет 7,5 ф 0,2.Смесь пробы сыворотки крови и реакционного раствора инкубируют, после этого определяют концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длиневолны 475-485 нм.П р и м е р 3. Для определения сосодержания глюкозы в спинномозговойжидкости применяют реакционный раствор следующего состава:Фосфатный буфер,моль/л 0,09Глюкозооксидаза,ИЕ/лПероксидаза,ИЕ/л 15000Азид натрия,ммоль/л4-Ами нофе на з он,ммол ь/л 0,855Тимолммол ь/л 2,5Детергент(ВгЦ), 7 Исследуемую пробу пентрифугируюти после этого надосадочную жидкостьбез разбавления смешивают с реакционным раствором (рЦ 7,5+0,2). Затемконцентрацию глюкозы определяют фотометрически при длине волны 475-485 нм.11 р и м е р 4. Для определениясодержания глюкозы в моче применяли реакционный раствор следующегосостава:Фосфатный буфер,мол ь/л 0,09Глюкоз оок сида эа,ИЕ/лПероксидаза,ИЕ/л 15000Тимол, ммоль/л 2,54-Аминофеназон,ммоль/лАэид натрия,ммоль/л 12,3Этанол, моль/л 2,5Детергент(Вг 3-35), 7 2,5Значение рН реакционного раствора составляло 7,5+0,2.Исследуемую пробу мочи разбавлялидистиллированной водой до 30"кратногопервоначального объема, Смесь разбавленной пробы и реакционного раствора чнкубировали и после этого определяли концентрацию глюкозы спектрофотометрически при длине волны475-485 нм.П р и м е р 5. Для определениясодержания глюкозы в цельной кровиприменяли реакционный раствор следующего состава:Фосфатный буФер,моль/л 0,09Глюкозооксидаэа,ИЕ/л 12000Пероксидаза,ИЕ/лТимол, ммоль/л4-Аминофена з он,ммоль/л 0,8Аэид натрия,ммоль/л 12,3Этанол, ммоль/л 2,5Детергент(Вгд 3-35), Е 2,5Значение рН реакционного растворасоставляло 7,5+0,2.Цельную кровь депротеинировалиизвестным способом при помощи раствора трихлоруксусной кислоты, затемприготовили препарат крови в коли505444 40 Таблица 1 Тимол, ммоль/лЭкстицкция,11,1 ммоль/лЭкстракция,27,75 ммоль/л 1,330 2,000 2,500 3,000 4,000 5,000 0,330 0,365 0,370 0,370 0,370 0,370 О, 750 0,860 0,870 0,870 0,870 0,870 честве, соответствующем десятикратному количеству, указаццому в примере 1, и смешивали с реакционным раствором в количестве указанном в приФ5мере 1. Смесь ицкубировали и послеинкубации определяли концентрациюглюкозы спектрофотометрически придлине волны 474-485 нм.Определение наличия и количественные измерения глюкозы производят вдиапазоне коццентра 2, 775"33,300 ммоль/л. Данные частично сведены в табл. 4 ц частично представле-ны на фиг. 1 (в математическом выра-15жении).Из приведенных данных следует,что измерительная характеристика (вданном диапазоне) является линейной.Цветная реакция проходит полностьюи обеспечивает более точную возможность измерения глюкозы,Предлагаемый способ сравнивают сэталонным методом, в качестве которого служит известный метод ультрафиолетовой пробы на гексокицазу Беринга, В качестве раствора, содержащего сахар, в этом случае использу"ются 45 проб человеческой крови (безвыбора). Иэ фиг. 2 видно, что между 30результатами, полученными этими методами, нет никаких отличий, так каккоэффициент корреляции (г = +О,Ч 971)очень близок к теоретическому значению (1,000) и крутизна кривой регрессии отличается от теоретического значения лишь на 0,4%. Чувствительность, воспроизводимость и погрешностиметода определяются на основании полученных результатов измерения. Такая статистическая обработка дает следующие результаты (по отношению к глюкозе):чувствительность,ммоль/л +0,17 Точность, ммоль/л +0,09 Погрешность, 7. Предлагаемый реактив, кроме тогопригоден для количественного определения глюкозы в выделениях человекаи животных (например в крови, моче,лцкворе) и для определения содержания глюкозы в употребЛяемых человекомнапитках (например алкогольных напитках, соках, освежающих надитках) илидля измерения других растворов, содержащих глюкозу, холестерин или мочевую кислоту,Предлагаемый реактив превосходитизвестные тесты. Из количественного сравнения следует, что при использовании предлагаемого метода цвет со-г вершенно це меняется в течение по меньшей мере 240 мин, тогда как при использовании известных методов непрерывное снижение интенсивности окраски наблюдается уже через короткое время (45 мин, см. Рис. 2). Формула изобретения Способ определения глюкозы в биологических жидкостях путем помещения исследуемой пробы в раствор буферного вещества, дополнительно содержащего глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-амицофеназон, азид натрия и вещество взаимодействующее с 4-аминефе-, цазоцом, инкубации полученной смеси с последующим спектрофотометрироваццем о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа за счет стабилизации окраски реакционной смеси в качестве вещества, дополнительно взаимодействующего с 4-аминофеназоном, используют тимол в концентрации 2,3-2,7 ммоль/л при этом раствор буферного вещества содержит 0,6-1,0 ммоль/л 4-аминофеназоца, 12, 1-12,5 ммоль /л азида нат" рия, 10000-20000 МЕ/л пероксидазы, 8000-20000 ИЕ/л глюкозооксидазы, при РН 7,5+0,2, а измерение проводят при длине волны 475-485 нм.2 775 5 550 8 325 11,100 3 3 3 3 0,0950 0,1833 0,2783 0,3683 0,0951 О,860 0,2769 0,3679 О, 10 - 1,45 +0,50 +0,10 П р и м е ч а н и е. х - концентрация уравновешенной глюкозы, и - числопараллельных иэмерений; У - среднее значение измеренных экстинкций; У - экстинкции, вычисленные из сравнения калиброванных прямых; Й - разница между измеренными и вычисленными экстинкциями. Е = 246895; Е = 1,20746; (Г.С.: 6; 16) Р ) 0,10, где Г - проба регрессии;Г - проба линейности;Г.С. - степень свободы линейности;Р - достоверность линейности;так как это значение больше, чем 102, кривая откло) няется от прямой незначительно. и У У й, % Активность пероксидаэы, Е/млЭкстинкцияу27,75 ммоль/л 13,8 753 0,4616 0,4588 +0,61 16,6503 0,5500 0,5497 +0,05 22,20030,7300О, 7316