Способ получения пиримидиновых блоков

(61) М. Кл. С 07 Н 21/О 300301/23-0 единением заевиоритет -убликовано 1504 прис 3) П Гввдарвтввааы 1 аааататВавета Мааавтраа ВВФРае аваев авеврвтвааа .а етарытаР УДК 547.963.32. .07 (088.8).М.Мазо, Л.Л.Киселев и В.Ш.Шейнкер Заявитель Институт молекулярной биологии АН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРИМИДИНОВЫХ БЛОК бл Изобретение относится к способу пО, лучения пиримидиновых блоков, оканчивающихся с 3-конца адениловой или гуаниловой кислотой, которые могут на ти применение в фармакологии и биохимии. Известны способы специФического расщепления полирибонуклеотидов рибонуклеазами (гуанил-РНКаэа и пирими,пил-РНКаза) с предшествующей блокировкой определенных звеньев полирибонуклеотидов химическими модификаторами таким образом, чтобы специфические и неспецифические РНКазы не могли расщеплять связи между этими звеньями, вследствие чего приобретали новую специфичность. К таким способам относит-. ся расщепление полирибонуклеотида пиримидил-РНКазбй по цитидиновым звеньям после модификации уридиновых остатков водорастворимым карбодиимидом. Известно также, что гуаниловые звенья после их модификации кетоксалем становятся устойчивыми к действию неспецифической РНКазы Т.Целью изобретения является способ, позволяющий получать пиримидиновыеоки, оканчивающиеся с 3 -конца адениловой нли гуаниловой кислотой, путем избирательного расщепления полирибонуклеотидов по пуриновым звеньям рибонуклеазой Та,Предлагаемый способ заключается втом, что полирибонуклеотид предвари тельно обрабатывают смесью метоксиамина и метабисульфита натрия при рН7,010,1 и температуре 37-40 С, а затем подвергают расщеплению рибонуклеазой Тз.Ю Способ основан на устойчивости фосФодиэфирных 4 связей между 5,6-дигидроб-сульфо-Н -метоксицитидиловой и 5,6 дигидро-б-сульфо-уридиловой кислотами, полученными в результате обработтбки полирибонуклеотида смесью метоксиамина и метабисульфита .натрия, и со. седними с ними с 3 -конца нуклеотидами к расщеплению под действием рибонуклеазы Т. В результате происходит и 0 расщепление лишь по пуриновым остаткам полирибонуклеотида.Полученный пирнмидиновый блок может быть использован для синтеза фармакологических препаратов направленного действия, для синтеза полинуклеотидов заданной структуры, при анализепервичной структуры нуклеиновых кислот, как биохимический реактив.П р и м е р 5. 0,5 мг РНХ иэ рибосом выдерживают при 37 С в течение,Эаказ 1762/21 Тираж 559Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатент,.г. Ужгород, ул. Проектная, 4 4 час с,0,05 мл раствора, содержащего (г/л) 125 метоксиамина и 380 метабисульфита натрия.при рН 7,0+0,1.По окончании реакции инкубационную смесь разбавляют водой до 2,5 мл, до бавляют 0,002 мл раствора рибонуклеазы Т, содержащего не менее 500 единиц активности в 1 мл, и доводят до рН 5 ацетатом натрия. Раствор выдерживают 2 час при 37 фС, изменяют рН до )0 8 бикарбонатом аммония, добавляют 0,02 мл раствора фосфомоноэстеразы (0,6 г/л) и выдерживают еще.2 час при 37 С.Полученный образец упарнвают и Наносят на пластинку 16 х 16 см, покрытую тонким слоем целлюлозы (3,5 г). Пластинку помещают в герметичный резервуар, на дно которого наливают 100, мл раствора нормального бутанола, насыщенного водой. Восходящую хроматографию .в этой системе проводят при комнатной температуре в течение 3-5 час, пока граница поднимающегося раствора йе достигнет верхнего края пластинки.При такой хроматографии Устоичивыйк действию нуклеазы материал остается на месте нанесения, а неустойчивый движется в данной хроматографической системе.После расщепления материал можно разделить по длине цепи или по составу известным методом хроматографии на колонке, наколненной ДЭАЭ-Сефадексом Ас использованием раствора, содержащего мочевину (420 г/л)После такого разделения собранные продукты обессоливают пррпусканием через, колонку со смолой биогель Р или через колонку с ДЭАЭ целлюлозой. Способ получения пиримидиновых блоков, состоящих из цитидиловой и уридиновай кислот и оканчивающихся с 3-конца адениловой или гуаниловой кислотой,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что полирибонуклеотид предварительно обрабатывают смесью метоксиамина и, метабисульфита натрия при рН 7,0+0,1 и темпера-туре 37-40 С, а затем подвергают расщеплению рибонуклеазой Т,г,