Способ определения диклофенака натрия в биологической жидкости

СОВЕТСКИХЛИСТИЧЕСКИХБЛИК 4 С 01 И 33/4 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССРститут нницкии меди.46-49. 198 журн Изо на 3 мл пробы, рас водорода до конечн 0,49-1,96 мкмоль/3 ческую плотность о к областилогическимможет бытения колич ретение относится ны, а именно к био исследования, и овано для определ льтарена в биоловор пероксий концентрмл пробы, арашенного пре 30-60 мин аз едициетодам и оптип одукпри тва в гически формах нтервал остях или лекарствен вышение чувЦель изобретения - п ствительности способа.Постоянная цель дост что используется цветна вольтарена с пероксидом пероксидазой при рН инк среды в интервале 7,2-7На чертеже приведена ная кривая для определе на.Способ осуществляетс од окрашен я при рН и вале 7,2-7 н после пр.1.). огокубац тем,ияа иой етс в бавле реак водоро бацион 7. Максиго продрации пле 4-10симость алиброво вольтарел образом.К пробе, прибавляют 0 буфер с рН 7 дазы до коне шенного роксида В работ парат п ной акт ед.,2-7,7 раствор пероксичной активности 4-10(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИКЛОФЕНАКАНАТРИЯ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ(57) Изобретение относится к методамопределения вольтарена в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности способа -достигается тем, что определение ведут по цветной реакции вольтарена спероксидом водорода и пероксидазой,а окрашенный продукт реакции измеряют при 450;460 нм. Способ позволяетопределить 0,5 мкг диклофенака натрияв 3 мл пробы. 1 ил 8 табл. измеряют в и 450-460 нм.Максимальный вых продукта наблюдаетс онной среды в интер промежутке 30-60 ми ния реактивов (табл мальная плотность окрашеннокта наблюдается при концентроксидазы в пробе в интерваед активности на 3 мл. Завиоптической плотности окрапродукта от концентрации пеы в пробе приведена в табл.2 использован извсстный прероксидазы из хрена с исходвностью 650 ед/мг, Непосред 1471131ственно перед использованием проверяли активность препарата по методу Симакова, Обесцвечивание индигокармина определяли спектрофотометрически за 1 мин. Сухой препарат пероксидазы растворяли в дистиллированной воде до концентрации 20 в 1 ед. активности (мкмоль обесцвеченного индигокармина/мин) в 1 мл.10Максимальная оптическая плотность окрашенного продукта наблюдается при кднцентрации пероксида водорода в интервале 0,49-1,96 мкмоль/3 мл пробы, В табл, 3 приведена зависимость оптической плотности окрашенного продукта от количества пероксида водорода в пробе.20Максимум поглощения окрашенногопродукта находится в интервале 450460 нм (табл.4). Это свидетельствует,что в результате реакции пероксидаводорода и пероксидаэы образуется свольтареном качественно отличныйкомплекс по сравнению с известным.Максимум поглощения окрашенного продукта взаимодействия вольтарена с перийодатом натрия находится при 550 нм,Проведено экспериментальное сравнение чувствительности предлагаемогоспособа. определения вольтарена с таковой у известного. Оказалось, чточувствительность предлагаемого спосо 35ба примерно в 10 раз превосходит таковую в известном (табл.5), Линейнаязависимость между количеством вольтарена и величиной оптической плотности, как видно из табл,5 и чертежа, сохраняется в интервале 0,530 мкг.Воспроизводимость способа былапроверена на пяти параллельных определениях (табл.б). Коэффициент варнации составляет 2,24%,1Специфичность способа определения вольтарена была проверена на препаратах, назначение которых совместно с50 вольтареном наиболее вероятно (табл.7). Оказалось, что анальгин, индометацин, аспирин, эуфиллин не дают окрашенного продукта в условиях определения вольтарена. Лмидопирин в этих условиях дает слабо окрашенный продукт с другим максимумом поглощения (580 м), который к тому же исчезает в течение 10-15 мин. Возможность определения вольтарена в лекарственных Формах была проведена на иньекционном препарате вольтарена производства Фирмы Плива (Югославия) в сотрудничестве с Фирмой Сиба-Гейги. Оказалось, что содержание вольтарена в препарате, определенное предлагаемым способом, составляет 73,8 мг в 3 мл, что практически совпадает с концентрацией вольтарена, указанной в рецептуре - 75 мг/3 мл.Возможность определения вольтарена в биологических жидкостях была проверена на плазме крови и моче, к которым были добавлены различные количества вольтарена. Опыты показали, что прямое определение вольтарена в биологических жидкостях невозможно, так как после добавления реактивов окраска не развивается, Для определения вольтарена в биологических жидкостях необходима предварительная экстракция.Вольтарен иэ плазмы крови и мочи экстрагировали органическими растворителями из подкисленных проб, В качестве растворителя использован хлороформ. Для подкисления проб использовали 2,5 и. раствор фосфорной кислоты. Для оценки полноты экстракции вольтарена из биологических жидкостей были проведены опыты. Использованный способ экстракции обеспечивает практически полное извлечение вольтарена, добавленного к пробам плазмы крови и мочи (табл.8).С целью проверки специфичности способа экстракции экстрагировали также пробы плазмы крови и мочи людей, не получавших вольтарен. Опыты показали, что из биологических жидкостей не экстрагируются вещества, способные давать цветную реакцию с пероксидом водорода и пероксидазой. Определение концентрации вольта- рена предлагаемым способом в плазме крови больных, получивших вольтарен в процессе лечения ревматоидного артрита, показало близкие величины по отношению к результатам определения вольтарена другими методами. Через 30 мин после перорального введения 100 мг вольтарена в плазме крови больного было обнаружено 1,85 мгк/мл вольтарена. По известным данным че" рез 30-60 мин после введения вольта. рена в дозе 100 мг в плазме кровиО 20 25 30 5 14711больных выявляется 1,0 - 2,9 мкг/млвольтарена,П р и м е р 1, Определение вольтарена в инъекционном препарате,5Реактивы: препарат пероксидазыиз хрена производства НПО "Биохимреактив", г, Олайне, СССР с исходнойактивностью 650 ед/мг растворяли вдистиллированной воде и проверялиего активность по методу Симакова,дпя работы использовали препарат, содержащий 40 ед, активными (мкмольобесцвеченного индигокармина/мин) вмл; 9,8 ммоль раствор пероксидаводорода (0,02 мл 33%-ного растворапероксида водорода растворяли в 20 млводы); 0,1 моль калий-фосфатный буфер, рН 7,4.Ход определения.Инъекционный препарат вольтаренафирмы Плива с содержанием вольтарена75 мг/3 мл разводят в 100 раз дистиллированной водой.К 0,1 мл разведенного растворавольтарена прибавляют 2,7 мл калийфосфатного буфера (рН 7,4), затем0,1 мл раствора пероксидазы и 0,1 млраствора пероксида водорода, пробуперемешивают,Через 45 мин пробы Фотометрируютпри 455 нм на спектрофотэметре противконтроля, который содержит все реактивы, кроме вольтарена.35Расчет ведут по калибровочной кривой.П р и м е р 2. Определение вольтарена в плазме крови и моче,Реактивы: хлороформ; 2,5 н.растворфосфорной кислоты; раствор пероксидазы, содержащий 40 ед. активности в1 мл (приготовление аналогично примеру 1); 9,8 пароль раствор пероксидаводорода; 0,1 моль калий-Фосфатныйбуфер, рН 7,4.Ход определения,К 1 об. плазмы крови или мочи прибавляют 4 об, 2,5 н. раствора фосфорной кислоты и 5 об, хлороформа к1 мл плазмы прибавляют 4 мл 2,5 н.раствора Фосфорной кислоты и 5 млхлороформаПробы перемешивают путем переворачивания (не допуская вспенивания) в 3 6течение 15 мин, После расслоения фазхлороформный слой переносят в другуюпробирку,К ос.татку прибавляют такое же количество хлороформа и повторяют экстракцию, Хлороформные экстракты объединяют и упаривают досуха при 4060 С,К сухому экстракту прибавляют2,8 мл 0,1 моль калий-Фосфатного буфера рН 7,4, затем 0,1 млраствора пероксидазы и 0,1 мл.раствора пероксида водорода и пе-ремешив ают.Пробы Фотометрируют через 45 мин при 455 нм против контроля, который содержал все реактивы, кроме экстракта вольтарена.При концентрации вольтарена в плазме крови менее 1 мкг/мл можно использовать микрокюветы, пропорционально уменьшив количества прибавляемых реактивов или увеличить объемы плазмы взятых для экстракции,Использование предлагаемого способа определения вольтарена, более чувствительного (в 10 раэ) по сравнениюс известным, позволит определять концентрацию вольтарена в биологическихжидкостях не только в сучае этравления этим препаратом, т:.о и кон .ролировать его уровень в крови болььъ.х в процессе лечения. Это дает возможность при необхоцимости проводитькоррекцию доз вольтарена и тем самым повысить качествс лечения.Формула и з о б р е т е н и яСпособ определения диклофенака натрия в биологической жидкости путем экстракции, добавления к экстракту реагентов с последующим Фотометрированием раствора окрашенного продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью повышения чувствительности способа, в качестве реагентов используют раствор пероксидазы в концентрации 1,3-3,3 ед./мл, раствор перекиси водорода 0;49-1,96 мкмоль, буферный раствор с рН 7,2-7,7, а Фотометрирование проводят через 30-60 мин после смешивания реагентов при 450-460 нм.1471131 Т а блица 1 рНсреды Величина оптической плотности завремя после прибавления реактивов,мин 15 30 45 60 90 0,440 0,500 0,350 0,330 0,320 0,300 0,280 0,180 0,080 0,180 0,290 0,575 0,605 0,6 О 0,600 0,510 П р и м е ч а н и е, Б каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед. активности пероксидазы и 0,98 мкмоль пероксида водорода,Таблица 2 Величина оптической плотности за время после прибавления реактивов, мин Количество пероксидазы в 3 мл пробы, ед. активн. 60 15 30 2,0 0,175 0,510 4,0 0,350 0,605 6,0 0,490 0,600 8,0 0,590 0,600 10,0 0,600 0,590 12,0 0,610 0460 П р и м е ч а н и е, В каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 0,98 мкмоль пероксида водорода, рН инкубационной среды 7,4. Таблица 3 Величина оптической плотности за время после прибавления реактивов, минюе Количе"ство пероксидаводоро" да,мкмоль/ /Э мл 60 45 90 5 ЭО 0,395 0,420 0,430 0,430 0,405 0,385 О,250,2450,490,9896Э,92 П р и м е ч а и и е. В каждой пробе обьемом Э мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед, активности пероксидазы рН среды 74. 6,0 6,5 7,0 .7,2 , 7,4 7,5 77 8,0 0,240 0,350 0,500 0,580 0,585 0,580 0,565 0,360 0,375 0,465 0,595 0,595 0,585 0,485 0,110 0,220 0,450 0,590 0,600 0,600 0,590 0,480 0,420 0,600 0,610 0,605 0,605 0,540 О 340 О., 420 0,605 0,620 0,600 0,550 0,315 0,390 0600 0,6 О 0,6 О 0570 0,290 0,360 0,570 0,590 0,590 0,560 0,050 0,100 0,180 0,380 0,480 0,500 0,540 0,560 0,560 0,575 0,570 0,560 0,560 0,4101471131 Таблица 6 Таблица 4 Длина волны,Оптическаяплотность Длина Оптическаяплотность Количество вольтаре 5 на, мгк волнынм 20,0 20,0 20,0 10 20,020,0 0,585 0,610 0,595 0,605 0,620 430 0,180 460 435 0,240 462 440 0,370 464 445 0,538 466 450 0,585 468 452 0,600 470 454 0,610 475 456 0,608 480 458 0,605 485 Х = 0,603С = 0,0135 Ч = 2,247. Таблица 7 15 Препарат Количество, мг Результатопределениячерез30 мин Примечание. В пробе объемом 3 мл содержалось 20, мкг вольтарена, 4 ед. активности пероксидазы, 20 0,98 мкмоль пероксида водорода, рН 7,4. 20 0,605 ед. опт.плотВольтарен Индометацин 20 Анальгин 20 Амидопирин 20 Та блица 5 Количество Величина оптической вольтарена1,0 5,0 10,0 20,0 96,0 96,4 93,5 99,0 П р и м е ч а н и е. Определение вольтарена вели следующим образом; к пробе вольтарена прибавляли 3 мл 5 Е-ного раствора перйодата натрия в 753-ной серной кислоте. Окрашенный продукт фотометрировали через 15 мин при 550 нм на спектрофотометре (количество раствора перйодата натрия против такового в известном способе было уменьшено с 4 мл до 3 мл для уравнивания фотометрируемых объемов в известном и предлагаемом способах). 45 Моча 1,05,010,020,0 0,95 4,88 9,78 18,8 95,0 97,6 97,8 94,0 50 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0 0 0 0 О, 035 0,060 0,096 0,105 0,124 0,600 0,580 0,560 0,540 0,500 0,475 0,390 0,320 0,275 0,025 0,045 0,085 0,165 0,325 0,605 0,880 1,120 1,420 Величина Статистичесоптической кие параметплотности ры ности00О (слабаяокраска,исчезающаячерез 105 мин)О0 Количество вольтарена, мкгг П р и м е ч а н и е. Вольтаренприбавляли к пробам плазмы крови имочи объемом 0,2 мл..1471131 г Е.Пап дак Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгор Гагарина, 101 ЗаказВНИИПИ Составитель В.Митюшинхред А,Кравчук Корректор М.Пожо 03/47 Тираж 788 Подписи осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5