Способ определения эффективного тироксинового отношения в пробе крови

Союз Советских Социалистических Республик,71 3) Приорите 7.72 (32 асудврственный иомитетСовета Министров СССРпо делам изобретениЯи открытий(43) Опублик 33) США но 15.10,77. Бюллетень Ме икования описания 25.10,77 У ДК 615.361.44 1".(72) Автор изобретени Иностранец ерет Е, Минсей"Бик - Маллинкродт Хемише Продукте ГмбХ") СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОГО ТИРОКСИНОВОГО ОТНОШЕНИЯ В ПРОБЕ КРОВ 2 Изобретение относится к области медицины и может найти применение для точного определения функции щитовидной железы.Предлагаемый способ является новым и в патентной и технической литературе не описан,Для определения эффективного тироксинового отношения в пробе крови по предлагаемому способу смешивают раствор меченого гормона щитовид. ной железы с двумя порциями сыворотки крови, первая из которых по существу свободна от глобу. лина, связывающего тироксин, а вторая содержит ненасьпценный глобулин, связывающий тироксин, выдерживают в контакте с ионообменной смолой, после чего определяют отношение количества ме. ченого гормона щитовидной железы, связанного с глобулином, к количеству меченого гормона щитовидной железы, не связанного с глобулином.Кроме того, меченый гормон щитовидной железы содержит радиоактивный йод, а отношение объема первой порции сыворотки крови (без глобулина) к второй порции сыворотки крови (с глобулином) составляет 10:1 - 30:1,Способ осуществляют следующим образом. Ме. ченый реагент тироксина и глобулина, связанного с тироксином (Т 4, ТВ 6) представляет собой буферное разбавление ооъединенной нормальной сыворотки, содержащей барбитал и тироксин меченый3-125 и готовят его следующим образом.К 78 мл сыворотки добавляют 1850 мл барбитального буферного раствора с рН 8,6, содержащего2,39% барбитала натрия и 0,76% азида натрия (микробиологическое консервирование), рН доводят спомощью НС 1, Добавляют также небольшое коли.чество радиоактивного тироксина (Т 4) (около0,13 мкл) в качестве трассера для определенияэффективности экстракции.Готовят экстракционную колонку путем заполнения стеклянной колонки достаточным количеством ионообменной смолы с получением объемаслоя около 1000 мл при расходе жидкости около10 мл/мин. Для этой цели применяют сильнооснов.ную смолу типа четвертичного аммония. Например,можно применять промышленную смолу этого типа"Амберлит 3 РА", но можно также применять идругие анионно- или катионно избирательныесмолы,Смолу загружают в колонку в виде водногошламма, над смолой всегда поддерживают слойводьь Колонку соединяют с сосудом. содержащим6 раствор сыворотки, подлежащей экстрагированию, и начинают пропускать сыворотку ч;рез колонку,Периодически отбирают пробу элюзта (1 мл) иподсчитывают его радиоактивность для определения эффективности экстракции Рздисзкттгв ;стьд 0 лжна составлять 1 и меньше ст рад;оактнвности исходного раствора.Приблизительно к 8 мл барбитзльного буферного раствора добавляют достзтс яое количество(0,125 г ЕДТА = Мзг) двунатриевой соли ЕДТА длясоздания концеятрзшщ 0,1 мг/мл двунатриевой соли ЕДТА в элюате колонки (экстрагированныйраствор сьворотки). Растворение ЕДТА облегчает.ся при слабом нагревании. После охлаждения докомнатной температуры этот раствор добавляют вэлюат колонки(экстрагировзнный раствор сыворотки,Затем к элюату добавляют еще радиоактивныйтироксин (около 0,27 мкл) . Зкстрагированиыйраствор сыворотки затем пропускают черезфильтр 0,22.Затем отмеряют 11,580 мл буферного барби.тального раствора, содержащего 0,1 мг/мл динзтриевой соли ЕДТА, что равно шестикратномуобъему элюата. Затем этот раствор добавляют кэлюату, что обеспечивает шестикратное разбавлениеэлюата. Полученный реагент имеет рН 8,6, кон.центрация двунатриевой соли ЕДТА составляет0,1 мг/мл.Раствор сывороточногс тирсксина пригстовляют следуйщим образом,Отбирают около 10 мл испьпуемой крови и ейдают коагулировать. удаляют сыворотку и го каплям добавляют 1,0 мл сыворотки и 2 мл 95%-нсгсэтанола в пробирку для центрифутирования,Содержимое тщательно смешивают в скоростном смесителе для дензтурирования протеинов.Затем спиртовую смесь центрифугируют дс уплат.пения выпавшего йротеина на дне пробирки(2000 - 2500 об/мин) в течение 4 - 5 мин, Полученный верхний слой спиртового раствора, несодержа.щий протеинов, содержит около 80% от всеготироксина в пробе, Затем готовят раствор сывсрс.точного (ТВО) глобулина для связыващи тирскси.нз. Для этого порщпо испытуемой сыворотки(0,20 мл) добавляют к 4,0 мл барбитального буфера с рН 8,6 (получен как меченый реагент Т 4 ТВ 8).Этот раствор поставляет ненасыщенный ТВО пзиспьпуемой сыворотки, Вместо буферного раствора можно применять раствор в простой воде мень.щего количества сыворотки, например 5 или10 мкл, На каждый ксьшлект испытуемой сьлсротки обрабатывают контрольную сыворотгу точнотаким же образом, как и испытуемую сыворотку,включая приготовление растворов (контрольного)сывороточиого тироксина и глобулина, связаь".когоо тироксином. Контрольная сыворотка - зто промышленная нормальная сыворотка, содержащаянормальные количества тироксина н глобуппи,связанного с тироксином,Аликвоту раствора сывороточного тироксина(30 мл) добавляют к 4,0 мл меченого реагента тирсксина и глобулина, связанного с тироксином в сосуде. Сосуд закупоривают и растворы хорошо перемептявают. Затем к смеси растворов тироксина и реагента добавляют аликвоту (0,10 мл) раствора сывороточного глобулина, связанного с тирокси. ном.В сосуд со смесью трех растворов помещают полоску диска ионообменной смолы.После помещения полоски смолы сосуды со смесями и контрольной сывороткой закрывают колпачками и центрифугируют в течение 1 ч при комщтнсй температуре. Поскольку поглощение ра. диоактивного тироксина смолой является функци ей времени вращения важно, чтобы время вращения было одинаково кзк для испьпммои пробы, тзк и для контрольной. По истечении 1 ч вращения полос. ку смолы удаляют пинцетом и выбрасывают. Затем счетчиком определяют концентрацию меченого ти. роксина. В каждом сосуде должно быть не менее 10.000 счетов. Затем рассчитывают индекс, означающий эффективное тироксиновое отношение, следующим образом: Счет/мин для контрольнои сыно отки - он25 Счет/мин для испьпуемой- сыворотки - фонСостояние гормона щитовидной железы в пробах сыворотки от 209 пациентов было установленос помощью метода Беттингера, поглощения 3,35.-трийодтирснина и пробы Вроуна на сывороточныйтироксин, а также метода эффективного тироксинового отношения, По результатам обычных анализов рассчитан индекс свободного тироксина. Крометого, производилась клиническая оценка функциищитовидной железы у каждого пациента.Все пациенты в этом испытании были разделенына 5 групп на основе истории болезни, клиническихнаблюдений и результатов опытов:1, Неосложненная нормальная функция щитО видной железы (128) .2, Не осложненная гипофункция щитовидной же.лезы (9)3, Неосложненная гиперфункция щитовиднойжелезы (14).45 4, Нормальная функция щитОВиднОЙ железы убеременных (37),5. Нормальная функция щитовидной железынри лечении экстрогенами (21),Всего: 209.50 Из результатов обследования можно сделатьследующие выводы. В группе 128 пациентовнеосложненной нормальной функцией щитовиднойжелезы во всех опытах и по индексу свободноготироксина обследование показало, что у всех па 55 циентов щитовидная железа работает нормально,кроме 4-х случаев, когда по пробе на сывсротсчныйтююксин была установлена гипофункция щитовид.ной железы и по индексу свободного тироксинабыла установлена гипофункция щитовидной желе 60 зы.ба 7 Пределы эффективнога тироксинового отношения Гтп 1 етфупс 1 пая щитогиднай 1 нов 1 гцть тая +.".;цтсштл Гцпафупс 1 п;я щитовидной жслеы 1 ц.тав 11 днайсепезь 1желе ы Ж085 - 1,15 Более 1,15 111 енее 0,85 Формула изобретения Соетзвитеяь С. Маяготина Техред О, Пуговзя Корректор С. Патрушева Редактор 11. 1;гиеяьяновз Тираж 1101 Подниеное ЦНИИПИ Госудзр.-твенного когиитетз Совегз Министров СССР но деизм изобретения и о 1 крги тип 113035, Москва, Ж - 35, Раушская нзп, д. 45Заказ "949,701 Фидизя ППП "Патент", г. Ужгород, уя. Пректнзя, 4 В рупие 9 пациентов с неасложненной гипафункцией щитовидной железы все оПытЫ и индекс свобоцнога глроксица показали, что все пациенты отличаются гипофункпчай щитовидной железы, кроме одного случая, когда у одного пациента пс пробе на поглощеще 3,35 . трийодтироьптна уста новлена нормальная фушсция щитовицной железы.В группе 14-и пациентов с неослокненной гиперфункцией щитовидной железы все пробы н индекс свободного тираксина показап 1, что все пациенты отличаются гиперфутпсцией пщтовидной железы, кроме одного случая, когда у ттцного пациента по пробе поглощения 3,35 - трийодтгиронина была установлена нормальная футпсцт т кито. видной железь 1, у 2 пациентов по пробе 1 еа тироксин была установлена нормальная фупсция щцтовцццой железы, у 2 пациентов была установлена цаомальная функция щитовидной железы по индексу свободного тироксина.В ГруППЕ 37 ПацИЕНГОВ С НарМадътай;Ь:,ЧПСШт 1 ЕЙ щитовидной железы во время беремепсасти. тслька у 1 пациентки по пробе на поглоще,п 1 е 3,3"=- "трийодти ронина была установлена нор мгльная функция щитовидной железы, а у всех остальных пациентов по этой пробе установлена ппофункция щитовидной железы. Па пробе на тироксин у 4 пациентов из 37 была установлена гипафу 1 псция щитовидной железы, в то время как у осталыых 1. Способ определения эффективнага г 1 раксцнавого отношения в пробе крови, а тли ча тощий ся тем, что смешивают раствор меченого гормона щитовидной железы с двумя порциями сыворотки крови, первая из которых па существу свобОдна От глоаулцна, связывающего тираксцн, а вторая содержит ненасыщенный глабулин, связывающий тираксин, выдерживают в контакте с цанаобменной смОлОЙ, после чего Определяют Отцаше 3,", т.:;р;снтав ь большинстве случаев уровень сы.Ьоротап 1 аго тцраксцна был повышен, но в преое.лах для нормальной функции шцтави.1 най железы.По индексу свабалцаго тцраксцнз ц по эффектов.ному тироксцновому отношению по изобретению у всех 37 пациентов установлена нормальная функ.ция цгитавцднай железы.В группе 21 пациента, получавших лечение экстрогена" от, талька у 3 была установлена нормаль.10 нал функция щитовидной железы па поглощению3,3,5 - трийодглратптна, в та время как у Остальных 18 латцлентов па этой пробе была установлена гипо.фуьякцля щитовидной железы, по пробе на тироксин у 3 цз 21 пациентов была установлена гипер 1 б футпсция цпгговидной железы, в то время какуровень сыворотачного тироксина у остальных 18 пациентов в батьцпиствс случаев был повышен, пс в пределах нормальной функции щитовидной железы.По индексу свободного тираксина и по эффективному тцраксиновому отношению по изобре.те:ппо у всех 21 пациента установлена нормальная фуьпсция щитовидной железы. Согласно изобретеп 1 ю, клинические показания састаяьп 1 я щитовидной железы по эффективному тцроксцнаваму отношению можно устанавливать по пределам, указанным в таблице. опте 1 солцчества меченага гормона щитавцднаЙ железы, связанного с глобулинам, к количеству ме-нога гормона щцтовцднай железы, не связанногос глаауштцам.2. Способ поп. 1, а тли ча ю щи й с я тем,чта меченый гормон щитовидной железы содержит ра. диаактцвнь 1 й йод.3. Спасабпоп.1,отличающийся тем,что отношение объема первой порции сыворотки крови (без глобулина) к второй порции сыворотки крови (с глабулцном) составляет 10:1 - 30:1,