Способ получения меченных тритием дезокси-(5, 6 н ) цитидин-5 -моно-, -дии трифосфатов

-Камекецкая 2 26.07 (088.8) я, 1980,22,4,ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ РСНОМУ СВИДЕТЕЛЬС.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ДЕЗОКГИ-(5)6- Н ) -ЦИТИДИН- МОНО- -ЛИ- И ТРИФОСФАТОБ(57) Изобретение относится к химии меченных тритием дезоксицитидиннуклеотидов, в частности к дезокси- (5,6- Н)-цитидин-моно-(МФ),3-ди- (ДФ) и трифосфатом (ТФ), обладающим молекулярной радиоактивностью и используемым в биохимии, молекулярной биологии, генетике и экспериментальной медицине. Для выявленияболее высокой молекулярной радиоактивности у соединениГг указанного класса получены новые замещенныефосфаты новым способом. Последнийведут из (5,6-Д ) -цитидиитрифосфата инкубированием его с клеткамиЕ.со 11 К 12 Е 25, находящимися нахранении в музее культур микроорга.низмов Института молекулярной генетики АН СССР, обработанными эфиром,Процесс. ведут в буфере с рН 8,1;8,3в присутствии ацетата магния и дитиотрейтола с порционным добавлением креатиндюсфата, креатинфосфокнназы до образования ДФ. Для получения МФ продукт Дф гидролизуют в кислой среде при нагревании, а для образования ТФ ведут дополнительноеинкубирование с добавлением креатинфосфата и креатинфосфокинаэы. Способобеспечивает получение новых двакдымеченных тритием дозокснцитидиннуклеотидов с молекулярной радиоактивностью до 58 Кй/ммоль и выходом70 - 90 Х (без выделения промежуточных продуктов). 4 табл.1 1319503 гИзобретение относится к новому разморажиная их непосредственно передспособу получения ранее неописанных проведением реакции.меченных тритием де зокси-(5, 6- Н 1)" П р и м е р 2, Биосинтез дезоксицитидин-моно-, -ди- и трифосфа- (5, 6-фН)-цитидиндифосфата,тов. Меченные тритием деэоксицити Реакционную смесь, содержащую,днннуклеотиды широко используются мкмоль/мл:(5,6 - ф-цитидинтрифосфат3в биохимических исследованиях, иссле-0,4 (52 Ки/ммоль); дитиотрейтол 8;дованиях по молекулярной биологии, М 11(СНСОО) 1 О; Тг 1 з-НС 1 буфермолекулярной генетике и эксперимен- (рН 8,1) 40 и обработанные эфиромтальной медицине, В последние годы 10 клетки 2,5 мг (по белку) иа 1 мл ревозросли требования к молярной радио-акционной смеси, ннкубируют н водя/активности этих препаратов. ной бане при 37 С в течение 20 мин,Целью изобретения является разра- Затем три раза порциями через каждыеботка нового способа получения новых 20 мнн (т,е. через 20, 40 и 50 минкратно меченых дезокси-(5,6-ЗН)-ци инкубирования) добавляют по 0,4тидинмоно-, -ди- и -трифосфатов вы- мкмоль креатинфосфата и 0,1 мг креасокой молярной радиоактивности. тинфосфокинаэы. Через 80 мин инкуби"Способ осуществляют путем проверования реакцию останавливают удаледения реакции знзиматнческого восста- нием клеток центрифугированием приновления рибозы, входящей всостав 20 10000 об/мин и осаждают оставшийсядважды меченного тритием (5,6-Н) - н супернатанте белок добавлениемцитинтрифосфата, до 2 -дезоксирибо .-ной трихлор уксусной кислоты дозы с образованием дезокси-(5,6- Н ) - 5%-ной концентрации ее в объеме рецитидиннуклеотидон высокой молярной акционной смеси, Образовавшийся осарадиоактивности (до 58 Кн/ммоль), 2 док удаляют центрнфугнрованием. ЦеИзобретение иллюстрируется следую- левой продукт выделяют из реакционщими примерами, ной смеси с помощью колоночной ионоП р и м е р 1. Обработка клеток обменной хроматографии на ДЕАЕ-целЕ,со 11 К 12 Е 125 эфиром, люлозе в НСО Форме в градиенте конКлетки Е. со 11 К 12 Е 125 выращивают 30 центрации триэтиламмоний бикарбонапо известной методике при 30 С на та О, 05-0,3 М (рН 8,2), Скоростьполноценной питатегьной среде н ус- элюции 100 мл/ч, Выход дезоксиловиях интенсивной аэрации до стадии (5,6- Н)-цитидиндидюсфата по мечесредней логарифмической Фазы, Биомас- ному (5,6- Н)-СТР составляет 70%,су осаждают центрифугированием и 35 Готовый препарат с 1 = (5,6 - Н)-СДРз1трижды отмывают от среды физиологи- подвергают хроматографическому анализуческим раствором. в тонком слое на РЕТ-се 11 ц 1 ояе /"МегсЕ" (5 г клеток суспендируют н 35 мл в двух системах: 1 М МаС 1 и О, 15 М буфера, содержащего 0,5 ш .М сахарозы, НаС 1 в насыщенном растворе НзВОз .ПодСуспензию переносят в делительную 40 вижность (К) полученного препарата воронку н добавляют к ней 35 мл све- равна подвижности стандартного образжеперегнанного эфира Смесь очень ос- ца Й-СДР ("Кеапа 1", Венгрия). УФ- торожно перемешивают в течение 1 мин спектр препарата полностью соответи разделяют на две фазы, Эфирную фа- ствует характерному для него спектру, . эу отбрасывают. К отделенной суспен Радиохимическая чистота не менее зии клеток добавляют еще 18 мл буфеМолярная радиоактивность бра, содержащего 0,5 а М сахарозы и (5,6- Н)-СДР равна 52 Кн/ммоль, эту суспенэию осторожно наслаивают П р и м е р 3, Биосинтез дезоксив 6 центрифужных пробирок, наполнен- (5,6- Н ) -цитидинмонофосфата,-3ных 6-8 мл буфера, содержащего 0,8 ш 50 Состав реакционной смеси и усло- .М сахарозы. Клетки отделяют центри- вия инкубирования по примеру 2, Чефугированием при 7000 об/мин в тече- рез 80 мин инкубирования реакцию ние 8 мин. Полученный осадок суспен- останавливают удалением клеток центдируют в 15 мл буфера, содержащего рифугированием при 10000 об/мин. К 0 5 ш М сахарозы, Содержание белка в 55 полученному супернатанту добавляют)полученном таким образом клеточном 40%-ную НС 10 д до 10%-ной концентра" препарате составляет 25-,30 мг/мл. Об- ции ее н объеме реакционной смеси работаяные эфиром клетки хранят в за- для проведения химического гидролиомороженном виде при температуре "70 С, эа Й-СДР до Й-СИР. Смесь выдержива03 Формула изобретенияСпособ получения меченных тритием дезокси-(5,6-Н)-цитидин-моно- -ди- и трифосфатов о т л и -В 1ч а ю щ и й с я тем, что (5,6- На)- цитидинтрифосфат инкубируют с клетка-, ми Е,со 11 К 2 Е 125, находящимися на хранении в музее культур микроорганизмов Института молекулярной генетики АН СССР, обработанными эфиром, в буфере с рН 8,1-8,3 в присутствии ацетата магния и дитиотрейтола с порционным добавлением креатинфосфата и креатинфосфокиназы до образования дезокси (5,6- Н 1)-цитидин-ди 3фосфата, который или гидролизуют в кислой среде при нагревании с образованием деэокси-(5,6-Нд)-цитидин-монофосфата, или дополнительно инкубируют с добавлением креатинфосфата и креатинфосфокинаэы с образованием дезокси-(5,6- Н)-цити 3дии- .,трифосфата 3 3195ют в водяной бане при Т = 00 фС в.течение 10 мин,.затем нейтрализуютее добавлением 5 М КОН. Образовавшийся осадок КС 10, удаляют центрифугированием, Целевой продукт д(5,6 -Н) " цитидинмонофосфатапомеченому (5,6-Н -СТР составляет 80%,Готовый препарат д-(5,6-Н) -СИРподвергают хроматографическому анализу в тонком слое на РЕ 1-се 11 ц 1 оае("Иегс 1 с") в двух системах: 1 М ОаС 1 5и 0,15 И МаС 1 в насыщенном раствореНЗВО . Подвижность (К) полученногопрепарата равна подвижности стандартного образца д-СМР ("Кеапа 1", Венгрия). Радиохимическая чистота препарата составляет ие менее 95%. УФспектр его полностью соответствуетхарактерному для него спектру, Молярная радиоактивность.д-(5,6-Н) -СМР равна 52 Ки/ммоль,П р и м е р 4. Биосинтез деэокси(5,6- Н 1) -цитидинтрифосфатаСостав реакционной смеси и условия инкубиронания по примеру 2. Через 80 мин инкубирования в реакционную смесь добавляют 10 мкмоль креатинфосфата, О, мг креатинфосфокинаэы и ипкубируют ее еще в течение30 мин, Реакцию останавливают удалением клеток центрифугироваиием при3510000 об/мин и осаждением оставшегося в супернатанте белка добавлением. к нему 507-ной трихлоруксусной кислоты до 5%-ной концентрации ее вобъеме реакционной смеси. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Целевой продукт. И-(5,6-Н)- СТР выделяют известным способом,например, с помощью ионообменной колоночной хроматографии на ДЕАЕтцел э1 люлозе. Выход дезокси-(5,6-Н)-цитидиитрыфосфата по меченому (5,6- Н)4цитидинтрифосфату составляет 80%,Готовый препарат д-(5,6-Н) "СТР подвергают хроматографическаму анализув тонком слое на РЕ 1-целлюлозе("Мегс 1 с") в двух системах: 1 М ЯаС 1и в 0,15 М БаС 1 в насыщенном раствореН ВО (препарат предварительно гидролиэуют до д-СИР). Радиохимическаячистота препарата составляет не менее 95%, УФ-спектр его полностью со- .ответствует характерному для негоспектру, Малярная радиоактивность .д-(5,6- Н)-СТР равна 52 Ки/ммоль,Табл. 1-4 иллюстрируют выбор оптимальных условий проведения биосинтеза каждого из деэокси-(5,6-Н)-цитидинмоно-, -ди-, и -трифосфатов,Предлагаемый способ позволяет по"лучать дважды меченнье тритием дезоксицитидиннуклеотиды с молярной радиоактивностью до 58 Ки/ммоль без выделения промежуточных продуктов с выходом 70-80%,,Т аб лицаЙраюеры биосиитеза дезокси-(5,6-Н)-цнтидиннуклеотидов.Условия проведениябиосннтеза Выход целевого продукта, Х 30 9 Температура, С 80 70 40 3 4 0,3 1 ОфМ 4 ЕонценрацияМ 2 Ф 6 0,7,10 М 79 1,10 И 80 8 7 4,10 М 4 4 4 5,5 0 9 Н 3 68 9 0,25 1 О М 4 33 иойтол. 8.О 1 7 6 8 1,51 3 5 0,1 7 65 0 8 Частотакаждые добавления 1 О мнн порций Каждые 29 30 70 Величинапорциикреатинфос,3фата и по0 мг 0,4креатин"фосфокйказы,мкмоль й-(5;б-Н) " й" (5,6-Н) й-(5,6-ЗНСМРСДРСТР139503 Продолжение табл; 1 Условия проведениябиосинтеэа Выход целевого продукта, 3 тюв ат ают тютюеютаю а Витт штВютюю д-(5,6-З ) й-(5,6-ЗН) й-(5,6-.Н ) фф ПРСДРСТР ттт ттю юее тютю тт те тетютю тютетаюа еа20 .мин креатинфосфата Каждые 30 мин 36 30 35 Времяинкубации 40 мин 80 мин 10 55 Ф 10.40 мин + 231 минс креатинфосфатом80 мин +30 мин 2с креатинфо сфа том 65 10 82 Таблица 2Влияние концентрации буферов (Тгдв НС 1 илн НЕРЕЯ)на выход с-(5,6- 1)-СТР а аеш е ею та пешв швею ттше штолярность буферов 0,001 0,02 0,04 0,06 0,8Ю Ю Ш ВЮВВ ВыходЙ-(5,6- Н )ШСТР ЗХ 593 53753 803 аюша а веа вв е вва Вештешюаттшю шювт штиюватттвааеюаюттшви сТаблицамиВлияние количества добавляемой креатинфосфокинавына выход д-(5,6-1)-СТР Количествокреатинфосфокиназы,мг 0,0 0,.05 0,1 Выходй-(5,6-Н,)-СТР,Х 32 8 79 82 7039503 О Таблица 4Влияние количества взятого креатинфосфата ивремени дополнительного инкубирования прибиосиитезе д-СТР Количествокреатиифосфатамкмоль 40 20 Вьаодд-(5,6-ф ) -СТР,У 20 70 82 82 8 Время дополнительного инкубирования, мин 2 3 0 Вьиода-(5,6-Н,)-СТР,ж 8 6 83 Составитель В.Смолякоедактор Г,Вельская Техред Л.Сердюкова орректор М,Пожо Заказ 2488 Тираж 325 НИИПИ Государственного комитета СС по делам изобретений и открытий 3035, Москва, Ж, Раушская наб.