Способ получения сорбента для афинной хроматографии

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ н 1979364 Союз СоветскиаСоциалистическихРеспублик(61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 31.03. 81 (2) 3303955/23-05 511 М. Кл. з С 08 В 37/12 С 01 Н 31/08 с присоединением заявки М Государственный комитет СССР по делам изобретений н открытийА,А. Терентьев, Ю,С, Татаринов, С.К. Кр оносов;,И.Е. Малахов, Б,А. Кульнев, С.П. ФещенкА.К. Тагирова и Е.Г. Соломкоф -тй2-й Московский ордена Ленина государст нный:медицинский институт им. Н.И. Пирогова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ЬФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИМН () 1 тЫ ОМЕ 1 а О,Она где К К в прису натрия хлорид щическата створа терИзобретение относится к биологической химии, в частности к препаративной и технологической биохимии, и может быть использовано для получения и фракционирования белков крови человека и животных, различных ферментов к антигенно обособленных белков, появляющихся в крови онкологических больных, например альфа-фетовротеина и трофобластспецифического бета-глобулина.Известен способ получения сорбента для афинной хроматографии взаимодействием сефарозы с веществом формулы Однако, несмотря на широкое применение полученной по этому способутак называемой "голубой сефарозы" впрепаративной биохимии, этому сорбенту присущ крупный недостаток: стерические помехи, создающие затруднениядля аффинного взаимодействия данногосорбента с некоторыми белками. Вчастности, он имеет малую емкостьпо отношению к альфа-фотопротеину(20 мкг/мл) и трофобластспецифическому бета-глобулину (15 мкг/мл).Целью изобретения является увеличение емкости сорбента по отношению15 к альфа-фотопротеину и трофобластспецифическому бета-глобулину,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения сорбента для афинной хроматографии к100 вес.чсефарозы добавляют 80-100 вес.ч. раствора трихлортриазинав безводном ацетоне, содержащего1-3 вес.в трихлортриазина, перемешивают 10-15 мин при рН 8,0-8,5, от 25 мывают последовательно водным раствором ацетона и дистиллированной водой, добавляют 50 вес.ч. водногораствора, содержащего по 2-3 вес,%гептаметилендиамина и бикарбоната30 натрия, перемешивают 2-10 ч при ком9793 б 4 0-В 0 натной температуре, отмывают дистилированной водой, затем осуществляют взаимодействие полученного продукта с 2 вес.ч. вещества формулы (1) в присутствии 10 вес.ч. хлорида натрия и 2 вес.ч. карбоната натрия, тща тельно перемешивают и подвергают обработке при 55 С 10 ч.Вещество укаэанной формулы называется цибакрон синим красителем.Сорбент предназначен для аффинной 10 хроматографии альфа-фетопротеина и трофобластспецифического бета-глобулина, помимо этОго сорбент мажет быть использован для аффинной хроматографии тех белков, которые аффинны 15 к "голубой сефарозе".Полученный, продукт представляет собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, обладающий хорошими механическими и фильтруищи ЗН 1где й - Н,. БООИа,й - БО Ойа, Н,й - сефароза, выбранная из груп пы комерческих препаратов,например сефарозы 2 В, сефароза СЬ 2 В, сефароза 4 В, .сефароза СЬ 4 В, сефарозабВ, сефароза СЬ бВ. 4В результате синтеза сначала получается дихлортриазиновое производноесефарозы, в котором оба атома хлоравесьма активны в щелочной среде, поэтому реакцию проводят в избытке трихлортриаэина в течение короткого промежутка времени - 10-15 мин (избытоктрихяортриазина необходим, чтобы связать все активные гидроксильные группировки сефарозы, а короткий промежу"ток времени, чтобы не успеть отгидролизовать лишние атомы хлора ).Коньюгация дихлортриаэинового производного сефарозы с гептаметилендиамином проводится в присутствии биарбоната натрия, что обеспечиваетнеобходимую щелочную буферную емкостьсреды. Избыток гептаметилендиамина идлительность процедуры коньюгации( 2-10 ч) обеспечивают полноту связывания и отгидролиэовывание третьего 60( последнего) атома хлора, Полученноепроизводное сефарозы не содержитактивных (стерически доступных ) гидроксильных групп, они все блокированытриазином и содержат только активные 65 ми свойствами, поэтому его можноиспользовать в колоночной хроматографии. Он выдерживает максимальноедавление без нарушения фильтрующихспособностей от 50 см вод. ст. длясорбента, синтезированного на основе сефарозы 2 В, до 150 см вод. ст.для сорбента, синтезированного набазе сефарозы СЬ бВ. Количествосвязанного в сорбенте красителя,определяющееся путем гидролиза 1 млсорбента в 0,1 М НС 1 в течение 10 минпри 90 фС с последующей спектрофотометрией при б 10 нм, колеблется от0,85 мг цибакрона синего на 1 млсорбента, синтезированного на базесефарозы СЬ 2 В, до 1,52 мг красителя на 1 мл сорбента, синтезированного на основе сефарозы бВ.Полученный сорбент может бытьизображен в виде формулы,аминогруппы, которые могуг участвовать в дальнейших реакциях. На этом этапе синтеза полученное нами производное сефарозы с введенными в нее аминогруппами реагирует в присутствии карбоната натрия с цибакрон синим красителем. Цибакрон .синий краситель является производным трихлортриазина, в котором два атома хлора уже замещены, а один атом хлора остается реакциойноспособным и может реагировать со свободными (не ароматическими ) аминогруппами. Так как это последний иэ атомов хлора молекулы трихлортриазина, он менее реакционноспособен и для реакции необходим рН около 10-11 и повышенная температура ( 45 фС и выше, В данном случае реакция может идти только по свободной аминогруппе производного сефароэы и хлору цибакрон синего красителя, в результате чего получается описанный сорбент,Концентрация раствора трихлортриаэина не должна превышать 3, потому что трихлортриаэин плохо растворим в водных растворах ацетона и его избыток выпадет в осадок, а при добавлении раствора трихлортриаэина в безводном ацетоне к суспенэии сефарозы ацетон обводняется. Концентрация гептаметилендиамина более 3 нежелательна из-за слишком большого повышения рН среды (за 11и наступающего вслед10 )5 ствие этого щелочного гидропиза сефароэы и ухудшения ее фильтрующих имеханических свойств.Уменьшение концентрации трихлортриазина меньше 1 ) может привестик неполной блокаде всех реакционноспособных гидроксильных групп сефарозы и тем самым последующее присоединение цибакрон синего красителя может произойти по этим группам.Уменьшение концентрации гептаметилендиамина приводит к существенно 1му понижению емкости получаемого сорбента примерно в 4-5 раз), в товремя как концентрация бикарбонатанатрия может быть понижена до 0,5,а увеличена быть не может из-эаплохой его растворимости в даннойсреде,Хлорид натрия добавляют для того,чтобы избежать расплавления сефарозы, поэтому снижение концентрациинецелесообразно иэ-за ухудшения фильтрующих свойств сорбента, а увеличение затруднительно, так как приданных условиях он не растворяетсяполностью. Повышение концентрациикарбоната натрия при температуре55 ОС приводит к ухудшению фильтрующихсвойств сорбента вследствие частичного щелочного гидролиза сефароэы иее расплавления в связи с этим,уменьшение же концентрации карбоната натрия в смеси (меньше однойчасти) приводит к уменьшению емкости сорбента примерно в 2 раза. Таккак реакционная способность аминогрупп довольно высока, то тепловуюобработку вполне можно приводитьпри 45 ф С, но в течение 10 ч или при55 О С в течение 5 ч. Проведениеконьюгации по наименьшим значениямпризнаков способа (концентрация,время, температура), которые приведены выше, дает воэможность получитьсорбент, емкость которого в 4-5 раэменьше, чем у получающихся в приведенных примерах.П р и м е р 1. Сорбент общей формулы (11), где Й - сефароза 4 В,представляющий собой мелкогранулированный гель. сефарозы ярко-голубогоцвета, выдерживающий беэ нарушенияФильтрующих способностей 120 смвод. ст. и содержаший на 1 мл геля1,41 мг цибакрон синего красителя,приготовляется следующим образом. К100 г геля сефарозы 4 В добавляют100 мл ацетона, содержащего 2 гтрихлортриазина, смесь ставят намагнитную мешалку и перемешивают,добавляя по каплям 1 М раствор едкого натра, чтобы поддерживать рН8,0Такое титрование продолжается5 мин, пока рН раствора не установится на 8,0 и не перестанет снижаться,далее выдерживают.при перемешивании еще 5 мин и сефарозу отмывают последовательно 2 л 50-ного водного ацетона и 2 л дистиллированной воды набюхнеровской воронке. После отьывания сефарозу переносят в химический стакан, добавляют раствор в количестве 50 мл, в котором предварительно растворяют по 3 г бикарбоната натрия и гептаметилендиамина, и ставят на магнитную мешалку на 2 ч, послечего полученное производное сефарозы отмывают на бюхнеровской воронке2 л дистиллированной воды. Затемгель сефарозы переносят в химический стакан, добавляют к нему 2 г цибакрон синего красителя в порошке,10 г хлористого натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 г карбонатанатрия, еще раз тщательно перемешивают и ставят в суховоэдушный тер 2 О мостат при 55 С на 10 ч. Полученныйсорбент тщательно отмывают на бюхнеровской воронке дистиллированной во"дой до полного обесцвечивания промывной воды. В экспериментах по аффинной 25 хроматограции данный сорбент помимоальбумина и некоторых других сывороточных белков при пропускании черезнего сыворотки плода человека обратимо связывает альфа-фотопротеин, а ЗО при пропускании через него сывороткикрови беременной женщины обратимосвязывает трофобластспецифическийбета-глобулин.П р и м е р 2. Сорбент общей форЗ 5 мулы (11), где йз - сефароза 2 В, представляющий собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения Фильтрующих способностей давление в50 см вод. ст. и содержащий на1 мл геля 0,89 мг цибакрона синего,приготавляется следующим образом.К 100 г геля сефарозы 2 В добавляют100 мл ацетона, содержащего 1 г трихлортриаэина, далее продолжают попримеру 1, а коньюгацию с гептаметилендиаминрм проводят в течение 10 ч.Полученный сорбент в экспериментахпо аффиной хроматографии связываетальфа-фетопротеин. и трофобластспе-.50 цифический бета-глобулин, как и сорбент, описанный в примере 1.П р и м е р 3, Сорбент общей формулы (11) где Й - сефароза 6 В,представляющий собой мелкогранулиро ванный гель сефарозы ярко-голубогоцвета, выдерживающий без нарушения.Фильтрующих способностей давление130 см вод. ст. и содержащий на 1 млгеля 1,52 мг цибакрон синего краси теля, приготовляют следующим образом.К 100 г геля сефарозы бВ добавляют100 мл ацетона, содержащего растворенным в нем 3 г трихлортриазина, далееперемешивают 15 мин, поддерживая рН 65 8,5 добавлением 1 М едкого натра, 979364и продолжают процедуру по примеру 1.Полученный сорбент по своей биоспециФичности .аналогичен сорбенту, описанному в примере 1.П р и м е р 4. Сорбент общей формулы (11), где Й- сефароза СЬ 2 В, 5представляет собой мелкогранулированный гель сефароэы, окрашенный вярко-голубой цвет, .выдерживающий безнарушения фильтрующих способностейдавление в 70 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 0,85 мг цибакроиа синего. Этот сорбент приготовляютследующим образом. К 100 г геля се-,Фарозы С 1. 2 В добавляют те же вещества, в той же последовательности и в 15тех же условиях,как в примере 2. Полученный сорбент обладает аффинностью,аналогичной для, сорбента, полученногов примере 1.П р и м е р 5. Сорбент общей фор Омулы 111), где Н - сефароза СЬ 6 В,представляяций собой мелкогранулированный гель сефарозы, окрашенный вярко-голубой цвет, выдерживающий безнарушения фильтрующих способностейдавление в 150 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 1,43 мг цибакронсинего красителя получают следующим.способом. К 100 г сефарозы СЬ 6 В добавляют равное количество 3-ного раствора трихлортриазина в безводномацетоне, перемешивают в течение15 мин, поддерживая рН 8,5 добавлением по каплям 1 М раствора едкогонатра, отмывают водным ацетоном иводой и далее добавляют 50 мл водного раствора, содержащего по 2гептаметилендиамина и бикарбонатанатрия, далее процедуру осуществляютпо примеру 1. Полученный сорбент вэкспериментах по аффинной хроматографии ведет себя аналогично сорбен,ту, описанному и полученному в примере 1,Свойства сорбентов, полученных в 45 конкретных примерах следующие. Пример 1 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств 120 см вод. ст.давление), емкость - способен связать 10 мг альбумина; пример 2 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств давление в 50 см врд. ст емкость - 8 мг альбумина на 1 мл геля пример 3 - механические войства: выдерживает без нарушея фильтрующих способностей давление в 130 см вод. ст., емкость - 12 мг альбумина; пример 4 - механические свойства; способен выдержать без изменения Фильтрующих свойств давление 60 в 70 см вод. ст., емкость - 7 мг альбумина; пример 5 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих способностей давление а 150 см вод. ст., емкость - 10 мг 65 1 альбумина на 1 мл сорбента. Фильтрующие свойства сравниваются путем определения скорости протекания 0,1 М раствора хлористого натрия через колонки, наполненные сорбектами, как путем свободного протекания, так и под действием перистальтического насоса. В последнем случае отсутствие нарушения фильтрующих свойств констатируется, если скорость протекания (количество миллилитров за единицу времени ) через колонку с сорбентом совпадает с проспектными данными, характеристическими для данного типа перистальтического насоса.Емкость предложенного сорбента для альфа-Фетопротеина 2-5 мг на миллилитр, для трофобластспецифического бета-глобулина 4-6 мг на миллилитрПолученный таким образом сорбентобладает фильтрационными свойствамитакими же, как импортный фирменныйсорбент "голубая сефароза", не уступая ей по стойкости и стабильности.Но самое главное, что этот сорбентимеет новые биоспецифические качества. Он способен адсорбировать вэкспериментах по аффинной хроматографии некоторые новые белки, которые неспособен адсорбировать фирменныйсорбент "голубая сефароза", Этими белками являются альфа-фетопротеин итрофобластспецифический бета-глобулин,которые известны как раковоэмбриональные белки и используются в ранней диагностике рака, а именно для приготовления иммунодиагностикумов. Сравнивая емкость полученных нами сорбентов с фирменной "голубой сефарозой" по адсорбции сывороточного альбумина человека, получили следующиерезультаты. На 1 мл сорбента обратимосорбировалось, "голубая сефароза"10 мг альбумина, сорбент из примера 110 мг альбумина, сорбент из прииера 2 - 8 мг альбумина, сорбент изпримера 3 - 12 мг альбумина, сорбентиз примера 4 - 7 мг альбумина и сорбент из примера 5-10 мг альбумина,Таким образом, полученный нами сорбент, обладая хорошими механическими, фильтрующими свойствами и емкостью, не уступающими Фирменной "голубой сефарозе", имеет по сравнению с ней преимущества по биоспецифичности и может быть применен в препаративной химии белка для аффинной хроматографии таких раковоэмбриональных белков, как альфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин,10 979364 формула изобретения Способ получения сорбента для .афинной хроматографии, о т л и ч а ющ и й с я тем, что с целью увеличения емкости сорбента по отношению И к альфа-фотопротеину и трофобластспецифическому бета-глобулину, к 100 вес,ч. сефарозы добавляют 80- 100 вес.ч. раствора трихлортриазина в безводном ацетоне, содержащего 1- 10 3 вес.Ъ трихлортриазина, перемешивают 10-15 мин при рН 8,0-8,5, отмывают последовательно водным раствором ацетона и дистиллированной водой, добавляют 50 вес.ч, водного раствора,. 5 содержащего по 2-3 вес.Ъ гептаметилен,циамина и бакарбоната натрйя, перемешивают 2.-10 ч при комнатной температуре, отмывают дистиллированной водой, затем осуществляют вз,имодействие 20 полученного продукта с 2 вес.ч. ьещества формулы (1) юн нО щО рО,Омагде К - Н или 50 Ойа,й- ЯООИа или Н,в присутствии 10 вес,ч. хлоридария и 2 вес.ч. карбоната натриятельно перемешивают в подвергаюобработке при 55 фС 10 час.Источники информации,принятые во внимание.при экспертизе1. ВоЬпе Н.1, и др. АЕЕ 1 п 1 гусЬгощаСоргарйу оГ рЬозрйоЬцссо 1 пазе цз 1 щ С 1 Ьасеоп Ь 1 ц ГЗС-Л "-доогпа 1 оЮ сЬлваСорарЬу", т. 69, опублик. 1972, с. 209-214 (прототип). нат- тща- т Редакто ПодписноСР раж 514венного комитета Сетений и открытий35, Раушская наб.,., Заказ 9271/2 ВНИИ по 1130 35