Способ получения плацентарного лактогена

и 983127 ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советск ихСоциалистическихРеспублик//А 61 К 35/50 Ьоударотваивй комитат СССР ао долам иэоорвтекик и открьпнй(088.8) Дата опубликования описания 23.12.82(72) Авторы изобретения Шевченко, Д. Д. Петрунин, Т.,М; Цагараева и Н. И. Огольцова к 2-й Московский ордена Ленина государствениь институт им. Н. М. Пирогов(54) СП Изобретение относится к биохимии, в частности к препаративной н технологическойбиохимии, и может быть использовано для.,получения очищенных биологически активныхпрепаратов, применяемых в медицине с целью5контроля за развитием беременности, оденкифункционального состояния фето - плацентарнойсистемы и диагностики осложнений беременности,Известен способ получения плацентарноголактогена иэ плаценты путем экстракциитрис - глициновым буфером, последовательногоосаждения при рН 6,5 и,4,5 сернокислым аммонием, колоночной хроматографии на амберлите С 6 - 50, повторного осаждения сернокислым аммонием, диализа, лиофилизации, иэоэлектрического осаждения и фракционнрованиязтанолом (1),Однако этот способ трудоемок и не обеспечивает высокого выхода белка,Известен также способ получения плацентар. 20ного лактотена, включающий измельчеиие пла.центы человека, зкстракцию физиологическимраствором, обработку раствором риванола и. последующее выделение целевого продукта Щ,Известный способ также не обеспечивает достаточно высокого выхода белка, является длительным н сложным из - за необходимости использования дорогостоящих реактивов и обо рудования. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения плацентариого лактогена, включающему измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и последую. шее вьщеленне целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полученный осадок последовательно отмывают дистиллированИой водой, раствором хлористого. натрия и вновь дистиллированной водой, затем злюирущт насыщенным раствором двузамещениого гидрофосфата натрия, получен. ный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок растворяют в растворе хлористого натрия; фильтруют, полученную фракцию обрабатывают силикагелем, полученный осадок отмыва ют последовательно дистиллированной водой,98312 раствором сернокислого аммония и вновь дис. тиллированной водой, после чего элюируют Раствором углекислого натрия, элюат диализуют против гистиллировянной волы н лиофиггизирчот.р и м е р 1, Зрелую плаценту, отмытую от крови, измельчают, добавляя равный объем физиологического раствора, полученную смесь растирают до получения гомогенной массы и замораживают. После 3-кратного замораживания и оттаивания гомогенат центрифугируют в тече. 10 ние 30 мин при 8000 ц. К 500 мл полученной в результате центрифутирования надосадочной жидкости добавляют 500 г влажной окиси алюминиясмесь инкубируют прн постоянном помешивании 20 мин, затем центрнфугируют 15 20 мин при 8000 ц, надосадочную жидкость удаляют, а осадок отмывают 10 - кратным обьемом дистиллированной водь 1, трижды отмывают равным объемом 0%-ного раствора хлористого натрия и вновь отмывают 10-кратным объемом дистиллированной воды, каждый раз удаляя осадок с помощью центрифугирования, К отмь 1 тому таким образом Сорбенту добавляют 500 мл насыщенного раствора двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин 5 при постоянном помешивании, центрифугируют. К полученной надосадочной жидкости добавляют 500 мл 0,5 о.ного раствора риванола и оставляют на сутки при 4 С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 400 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, фильтруют через бумажный фильтр, Полученный фильтрат обрабатывают равным объемом влажного силикагеля, инкубируют при постоянном помешвании в течение 20 мин, центрифугируют 20 мин при 8000 ц,Осадок отмывают 10 - кратЭ 5 ным обьемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом 30%-ного раствора сернокислого аммония и вновь 10 - кратным объемом дистиллированной воды. К полученному при помощи40 центрифугнрования сорбенту добавляют 300 мл 10%-ного раствора углекислого натрия, инку.бируют 20 мин, осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость диализуют про тив дистиллированной воды и лиофилиэируют, Таким образом, из 1 кг плаценты получают 35-40 мг препарата плацентарного лактогена с чистотой 95%.П р и м е р 2. Зрелую плаценту экстрагируют физиологическим раствором и адсорбируют на окиси алюминия, как описано в примере 1, Сорбент отмывают 10 - кратным объемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом8% ного раствора хлористого натрия и вновь 10-кратным объемом воды. К отмытому адсор. бенту добавляют 400 мл насыщенного раствора 55 двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин, центрифугируют при 8000 ц 20 мин. Надосадочную жидкость осаждают ри. 7 4ванолом, как описано в примере 1. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 300 мл физиологического раствора, фильтруют, нолуче 1 шый фильтрат адсорбируют на силикагеле, как описано в примере 1, сорбент отмывают 10-кратным объемом дистил лированной воды, З.кратным объемом 35%-ного раствора сернокислого аммония и вновь 10- кратным объемом воды, К отмытому адсорбенту добавляют 150 мл 8 оного раствора, углекислого натрия, инкубируют 20 мин, осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Получают 40 - 45 мг препарата плацентарного лактогена, с чистотой 90 - 95%.П р и м е р 3. Плаценту обрабатывают, как описано в примере 1. Полученный препарат плацентарного лактогена растворяют в физиоло. гическом растворе ( мг препарата в 1 мл раствора), добавляют 1 мл 2% ного раствора алюмокалиевых квасцов в качестве альюванта и, используют для получения антисывороток.Таким образом, используя предлагаемый, способ, из 1 кг сырья (плаценты) можно полу. чить 40 мг препарата плацентарного лактогена с чистотой 95%, обладающего хорошей иммуно. генностью для кроликов, в то время, как по известному способу 10 - 15 мг изкг сырья, т, е, предлагаемый способ позволяет получить препарат не уступающий по качеству известному. втрое увеличив при этом его выход, Способ также отличается технической простотой и непродолжительностью, не требует применения дорогостоящих реактивов и оборудования. Формула изобретения:,Способ получения плацентарного лактогена, включающий измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обра. ботку раствором риванола и последующее вы. деление целевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полу. ченный осадок последовательно отмывают дистил лированной водой, раствором хлористого натрия и вновь дистиллированной водой, затем элюируют насьпценным раствором двузамещенного гидрофосфата натрия, полученный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок растворяют в растворе хлористого натрия, фильтруют, полученную фракцию обрабатывают силикагелем, полученный осадок отмывают последовательно дистиллированной водой, раствором сернокислого аммония и вновь дистиллированной водой, после чего элюируют раствором углекислого натрия,Составитель В. БрусиловскаяТехред Ж.КастелевичКорректор Н БУРяк Редактор Г. Волкова Тираж 388ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытийИ 3035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 9834/29 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 983127 6элюат диализ 1 гйт против дистиллированной степае . пипцпо 1 одса 11 у ге 1 етес 1 то рИцйагуводы и лиофилизирувт, ЯгоччФ Ьогаопе. - ЕпдосгЬо 1 о 11 у", ч, 71,Источники информации, рр. 209 - 220, 1962,принятые во внимание при экспертизе 2. ВоЬп Н. Кгвта 11 аабоп апд Носпдеге. Зоаптюч 1 сй А В. и Мас 1 агеп А А, Рге пщцпя деа Нцпап Р 1 асепта 1 астояепа. -аепсе Ь Фе аеап о 1 а Ьоиру 1 астодепс ацЬ- "ЕрепещЮа, 1971, ч. 27, р. 1223.