Способ получения иммобилизованной липазы

Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)М. Кл.С 12 М 9/18 С 12 Й 1/08 Государственный комитет СССР во делам изабретени 11 и открытий(53) УДК 577 15 .07(088,8) Дата опубликования описания 23,11.81, гСреднеазиатский научно-исследовательский и проектноконструкторский институт пищевой промышленности(54) СПРОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙЛИПАЗЫ 0 Н ИО Н и обработку исовом соотнош3,0):)00 и тетого, обработ носителя ведут при в нии соответственно (О мпературе 45-80 С, Кроу ведут ири рН 8,0-9,дельнавое ма Изобретение относится к технической биохимии, в частности к способам получения иммобилизованной липазы,Известен способ получения иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя (капрон) би -5 функциональным реагентом, в качестве которого используют глутаровый альдегид, при щелочных значениях рН, температуре 0 С и весовом соотношенииоглутаровый альдегид: носитель (0,3810 0,39): 1 и связывание липазы с полученным носителем также при щелочных значениях рН.Обработку носителя глутаровым аль 15 дегидом обычно проводят при рН 8,5 в течение часа, а связывание с ферментом - при 4 С в течение 12 ч 1 1,Однако для данного способа характерна недостаточно высокая активность и термостабильность получаемого про". дукта.Достигаемая у я активность 0.8 ед/г (хлопко сло) и 213 ед/г 2(трибутирин), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составляет 0,66 и 0,01 (соответственно на указанных субстратах). Время полуинактивации при 50 С состав" ляет 2,5 ч (за час иммобилизованный фермент теряет 207 активности).Целью изобретения является повышение активности и термостабильности иммобилизованной липазы.Указанная цель достигается тем, что в качестве бифункциональиого реагента используют госсипол формулыВремя полуинактиации при 50 С, ч Удельная активность препарата,е// г Способ Сшивающий агент Хлопко- Трибутивое мас- ринло Извест- Глутароный вый диальдегид О, 8 213 0,66 0,0 2,5 ПредГоссилагаемый 250 0,77 0,17 14,0 пол Растворимаялипаза 323 80 П р и м е ч а н и е. А, А - удельные активности, измеренные с трибуТ 6 фтирином и хлопковым маслом, р - растворимый фермент, и - иммобилизованный;А /А - отношение удельных активностей иммобилий Рзованных и растворимых липаз,з 88в течение 1-5 ч. При этом связываниелипазы с носителем осуществляют при0-6 С.Активность фермента определяют поего способности расщеплять хлопковоемасло и трибутирин,П р и м е р 1. 10 мг порошкообраз"ного лолиамида обрабатывают 4 н. НС 1(1 мп) при 450 С в течение 2 ч, затемпромывают трижды дистиллированной водой (по 5 мл). Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин). К влажномуосадку добавляют 2 мп раствора госсипола в 0,1 М Ооратном буфере с рН8,8 с концентрацией 0,05 мг/мп и вьдер.живают при 80 С в течение 1 ч. Избытокгоссипола удаляют центрифугированием(5 мин, 2000 об/мин) с последующим про.мыванием осадка ацетоном(3 х 2 мл),Для подсоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному порошку, его промывают 0,1 М боратным буфером с рН 8,8 (2 х 5 мп) и добавляют 1 мп раствора липазы с концентрацией 10 кг/мл и инкубируют в течение,6 ч при 4 С. Полученный целевой Из таблицы видно, что применениегоссипола при прочих равных условияхпозволяет повысить каталитическую ак 3173 4продукт промывают 0,1 М боратным буфером, а затем дистиллированной водой.Активность фермента измеряют по егоспособности расщеплять хлопковое масло.П р и м е р 2, Все операции проводят, как в примере 1, но концентрациягоссипола 0,005 мг/мп, температура45 С, время 5 ч.О При концентрации сшивающего агента 0,005; 0,01; 0,025; 0,05 мг/млудельная активность ( с хлопковым маслом) составляет 10,2; 14,0; 9,0 и8,2 ед/г соответственно.15 При соотношении (по весу) сшивающего агента и носителя 0,25: 100;0,5 : 100; 1 : 100; 2 : 100; 3 : 100удельная активность соответственно13,1; 13,5; 14,0; 13,7; 14,0 ед/г,20 При рН среды 7,5; 8,0; 8,5; 8, 8;9,5 удельная активность соответственно 2,0; 7,0; 14,0; 13,7 и 5,0 ед/г.В таблице приведены результаты сравнения каталитической активности и стад бильности нерастворимой липазы полученной по предлагаемому способу иизвестному,тивность, Кроме того, целевой продукт,полученный по предлагаемому способу,обладает высокой стабильностью. Время883173 Ьреагента используют госсипол - соединение формулы ОИ Ой Н ормула изобрет 1, С ной лип ботку и бифункц альдегид и связь носител тем, ч ти и т дукта,Составитель о. Скородумовактор И, Николайчук Техред 3, Фанта Корректор Г.Решетни Тираж 531 Подписное НИИПИ Государственного комитета ССС по делам изобретений и открытий 035, Москва, Ж, Раушская наб., д"Патент", гУжгород, ул. Проектная лиал 5полуинактивации при 50 аС составляет 3,5 ч. вместо 2,5 ч, а при 20 С фермент может функционировать от 48 ч до 30 сут. Таким образом, изобретение прэволяет повысить каталитическую активность иммобилизованного фермента в 1,5-2 раза и увеличить стабильность нерастворимой липазы, а следовательно, и длительность использования,пособ получения иммобилизованазы, предусматривающий обраолиамидного носителя - капрона иональным реагентом, несущим ные группы, в щелочной среде гвание фермента с полученным ем, о т л и ч а ю щ и й с я о, с целью повышения активносрмостабипьности целевого пров качестве бифункционального а обработку им носителя зедут при веО совом соотношении соответственно(0,25-3,0) г 100 и температуре 45-80 фС.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю-,щ и й с я тем, что обработку носителя госсиполом осуществляют при рН 8,0 г 5 9 5 в течение 1-5 ч,3. Способ по п, 1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что связывание липазы с носителем осуществляют при 0-16 С.Источники информации,2 ф принятые во внимание при экспертизе1. Рахимов И. И. Джанбаева Н. Р,и Березин И. В, Субстратная специфич"ность иммобилизованных липаз. ДАНСССР, 1976, т. 229, В 6, 1481-48625 (прототип).