Способ определения активности гидролаз

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДИТИЪСТВУ Союз Советски нСоциалистическихРеспубиии а 873121(51)М. Кл. Ркударетеанныб квинтет СССР не делам нэебретеннй н открытейОпубликовано 15.10.81. Бюллетень М 38 Дата опубликования описания 15.10.81(72) Авторы изобретен Малин аус Ю. Кулис, В. И. Разумас 1) Заявите Н Литовской СС ститут биохи КТИВНОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕ ГИДРОЛАЗческим данным - величине оптической плотности - судят об активности фермента 1.тЗ,Недостатком данного способа является невозможность определения активности в непрозрач. ных и окрашенных средах, а также то, что он включает дополнительную процедуру спектрофотометрического определения продукта реакции в присутствии дополнительных реагентов. Данный способ не поддается автоматизации.,Целью изобретения является упрощение процесса и обеспечение возможности определения активности в непрозрачных и окрашенных среИзобреости гид может ение относится к определению актив ролиэирующих ферментов (гидролаз) быть применено в биохимии и в мея определения активности этих .фер. днцине длментов,Извес н спектрофотометрический или флу.тй способ определения активности гидщих ферментовзаключающийся вскорости образования хромофорныхрофорных продуктов 1.этот способ не применим дляред, кроме того, требует дорогратуры. обом оп ючаюмим стратом, эфир, об.катехин. Поставленная цель достигается сносределения активности гидролаз,заклся во взаимодействии фермента с субпредставляющим собой органическийразующим в результате реакции пироион или п-аминофенолят-ион, и опредличества последних в присутствии элеческого преобразователя при потенци0,18 - 0,3 В путем измерения тока. Поти нарастания тока судят об активностимента,м к предлагаемому является активности гидролаэы, в фосфатазы, заключающийся в буферном растворе фер. , представляющим собой фосфорной кислоты, и оп. а высвобождающегося в хоого фосфата спектрофотомет рисутствии специфических енным спектрофотометриНаи лее близки пределения тимелочной одействии субстратом ский эфир количеств свободн путем в п в. По получстн во взаиммента сорганичеределенииде реакции енин е анода скорое. рическимреаг енто оросцентнь ролизирую регистрации или флуо Однако зрачных с яшей аппа 6 01 й 31/14С 12 й 9/16С 12 й 9/24С 12 а 1/42873121 20 Обычно вкачестве гидролаз используют ше.лочную фосфатазу или 11-глюкозидазу, в первомслучае в качестве субстрата обычно используютмоноортофосфат пирокатехина или моноортофосфат и амийофенола 0,18 - 2 мм, а в качестве буферного раствора - 0,1 - 0,2 М трис-НССбуфер, содержащий 0,01 - 0,02 М Мц 804, во вто.ром случае в качестве субстрата обычно исполь.зуют Р-О.глюкозид п.аминофенола 0,18 - 3 мМ,а в качестве буферного раствора - 0,1 - 0,2 М 1 Оацетатный буфер,В качестве щелочной фосфатазы обычно используют также ферментативные системы интактных клеток Е соН (т.е. щелочную фосфатазу,содержащуюся непосредственно в упомянутыхклетках), при этом в качестве субстрата используют моноортофосфат пирокатехина в количестве 0,18 - 3 мМ, а в качестве буферногораствора - 0,1 - . 0,2 М трис-НС буфер, содержащий 0,01 - 0,02 М Мц 304.Существенными отличиями способа являются: использование в качестве субстрата эфира,образующего в результате реакции пирокатехинион или п.аминофенолят-ион, определение количества последних в присутствии электрохимического преобразователя при потенциале анода0,18 - 0,3 В путем измерения тока, а также то,что об активности фермента судят по скоростинарастания тока,На чертеже изображен электрохимический. преобразователь.Для осуществления способа применяют электрохимический преобразователь, состоящий изплатинового анода, электрода сравнения и вспомогательного электрода (смчертеж), Потенциал анода подбирают в интервале 0,18 - 0,3 В, 35в зависимости от конкретной системы,Способ включает следующие операции: растворение субстрата в буферном растворе, погружение в упомянутый раствор электрохимичес.кого преобразователя, введение в раствор определяемой гидролазы, наложение напряжения,измерение тока.П р и м е р 1. Для определения активностищелочной фосфатазы берут 0,1 М трис.НСР,0,01 М Мц 804 буфер, который содержит 2 мМ 45моноортофосфат пирокатехина или 1 мМ моноортофосфат п-аминофенола, рН - 8,0,25 С.В раствор погружают электрохимический преоб.разователь и вводят пробу щелочной фосфатазы,Если в качестве субстрата применяют моноор Отофоефат пирокатехина, потенциал анода усТанавливают 0,3 В относительно Ац/АцСР электро.да, если в качестве субстрата применяют моноортофосфат - п-аминофенола, потенциал анодаустанавливают 0,18 В относительно Ад/АцССэлектрода, Регистрируют увеличение тока вовремени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измере.ние занимает 1 - 3 мин (см, табл, 1 и 2). Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноорто. фосфата пирокатехина приведено в табл. 1.Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноортофосфата и аминофенола приведено в табл, 2.П р и м е р 2. Для определения активности 11.глюкозидазы берут 0,1 М ацетатный буфер, который содержит 1,5 мМ 11.0-глюкозид п.ами. нофенола рН - 4,7, температура 25 С. В раствор погружают электрохимический преобразо. ватель и вводят пробу определяемой Р-глико. зидазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В, относительно Ац/АцСВ электрода. Регистрируют увеличение тока во времени, Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1 - 3 мин. Измерение количества Р-глюкозидазы приве. дено в табл. 3.Регрессионный анализ результатов определения показывает хорошие совпадения результатов предлагаемого способа с известными спектрофотометрическими способами, коэффициенты кор- реляции для примеров, приведенных в табл. 1, 2 и 3, равны соответственно 0,9998, 0,9989, 0,9999.П р и м е р 3. Для определения активности щелочной фосфатазы непосредственно в интактных клетках Е.соб берут 0,1 М трис-НСВ 0,01 М Мц 804 буфер, содержащий 2 мМ моно. ортофосфат пирокатехина, рН - 8,0, при 25 С. В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу определяемой гидро- лазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В относительно Ац/АцСР электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности, Измерение занимает 1 - 3 мин. Определение активности щелочной фосфатазы непо. средственно в интактных клетках Е. со 5 приведено в табл, 4. Из табл. 4 видно, что,наблюдается строголинейная зависимость между количеством кле.ток и определяемой ферментативной активностью,П р и м е р 4. Зависимость скорости увеличения тока преобразователя от концентрации ферментов описывается Михаэлисовской зависи. мостью. Зависимость скорости увеличения тока от концентрации субстратов устанавливают при концентрации щелочной фосфатазы по обоим субстратам 0,026 ед/мл, рН 8,0, в 0,1 М трис- -НСВ, 0,01 М Мц 804,25 С. Потенциал анода для моноортофосфата п.аминофеиола 0,18 В относительно Ац/АдСВ электрода. Концентрации 11.глю. козидазы по Р-Р-глюкозиду и-аминофенола 0,018 ед/мл, рН = 4,7, в 0,1 М ацетатном бу.Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин Количество щелочной фосфатазы, 10", ед/мл 3,66 2,6 5,0 5,2 6,71 7,8 8,0 10,41,6 13,0 15,6 13)0 12,66 19,33 23,4 Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин Количество щелочной фосфатазы, 10 ед/мл 2,6.2,3 7,8 20,7 13,0 39,3 23,4 Количество Р-глюкозидазы, 0 з ефмл Скорость изменения токапреобразователя, нА/мин 3,7 0,73 7,4 1,53 14,5 2,6 22,3 3,4 37,0 6,5 5 873121 6фере, при 25 С. Потенциал анода 0,3 В относи- ти увеличения тока от концентрации субстратательно АоАдС электрода, Зависимость скорс. в присутствии гидролаз приведена в табл. 5.Таблица 1873121 Таблица 4 Количество клеток в см Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин 46 10 9,2 10 13,8 10 18,4 10 23 10 1,47 2,87 4,5 5,95 7,3 Таблица 5 Щелочная фосфатаза р- Глюкозидаза ф О.Глюкоэидаминофенола Моноортофосфати-аминофенола 1 нА/мин С, мМ нА/мин С, мМ нА/мин С, мМ 38 0,1744,7 0,246 0255203362,3 0,563,7 1 0,2 14,33 0,25 15,6 0,33 21,53 0,5 28 29,33 2. Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве гидролазы используют щелочную фосфатазу, в качестве субстрата ис. пользуют моноортофосфат пирокатехина или моноортофосфат п-аминофенола 0,18 - 3 мМ, а в качестве буферного раствора - 0,1-0,2 М трис.НСВ буфер, содержащий 0,01 - 0,02 М Мд 8043. Способ по пп, 1 и 2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве гидролазы используют 3.глюкозидазу, в качестве субстрата используют Р-О-глюкозид и-аминофенола в количестве 0,18 - 3 мМ, а в качестве буферного раствора 0,1 - 0,2 М ацетатный буфер.4. Способ по п, 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют щелочную фосфатазу, содержащуюся непосредственно в интактных клет. ках Е. со,при этом в качестве субстрата используют моноортофосфат пирокатехина 0,18 -1. Способ определения активности гидролаз,3 Ьвключающий взаимодействие фермента с субстратом, представляющим собой органический эфирв буферном растворе и определение количестваобразующихся в ходе реакции продуктов, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и обеспечения возможности определения активности в непрозрачных и окрашенных средах, в качестве субстрата используютэфиры, образующие в результате реакции пирокатехин-ион или п.аминофенолят.ион, количественное определение последних осуществляют в-присутствии злектрохимического преобразователя при потенциале анода 0,18 - 0,3 В путем измерения тока и по скорости нарастания токасудят об активности фермента,Моноортофосфат пирокатехина Формула изобретения 1,16 0,29 1,78 0,29 233 0,17 2,6 2,33 2,8 4,66 21 93873121 Составитель О, СкородумовТехред , А,Савка ктор П. Коссей екмар орре Заказ 9023/69 Тираж 910 П ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5"Патен ал 3 мМ, а в качестве буферного раствора -0,1-0,2 М трис-НСе буфер, содержащий 0,01 -М 2 М М 9804Источники информации,принятые во внимание при экснертизе1 Н И. Р:",-пеуе;. ".МеЮода о 1 Епзугпат 1 сд,. в ,.-1 ег-,с 1 теаз цо у 1 опдоп 198 783.2,ЕЫ й. ФПагп Е. М. 1.апдз, "А пеа ВепытКе Оетеггппабоп оФ РЬоарЬате", Апа, Вос;ег. ЗЙ";"., Гб 7 (прототип).