Способ получения биомассы микроорганизмов

Мл Союэ Советсиик СоциалистическиРеспублик РЕТЕ АТЕЯТУ(31) рственный комитеСССРлам изобретенийи открытий Го(33 ень Мо 45 Опубликовано 071280.6 юл Дата опубликования описаиЯ 07,1180 Иностранцы Мичихико Нодэири, Кацуо Какутани, Сигезо Уедон Кацуо Уенакаи и Масафуми МацумотоАвторыэобретени Иностранная Фирма нджиниринг Энд Юипб) Заявитель 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВкрахмалсодержащее сырье разжижают . путем добавления декстриногенного ферментаст-4-глюкан-глюкан-ги.дролазы, полученной из Вас 111 цв вцЬС 111 в чаг В 1 ОСесцв, а выращиван дрожжей осуществляют. непосредствен но в процессе ферментативного гидр лиза сырья, причем культивируют дрожжи нидов СапО 1 да цс 111 в или ЙЬОе 10 согц 1 а 9 Гдс 1111 в,Способ осуществляют следующим о разом. И логиче способ тивиро малсод разжиж мощью ИэвмалсодекстриноментовПолу сырье поспользонароорганизо Р эким к изобретениюением является спосссы микроорганизмовий Ферментатинныйалсодержащего сырьяжжей и отделение би о 20 ыичени Цель изобретенияда биомассы. Поставленная цело перед Ферментат ами.В кичныеала,стве сырья используют раз стительные источники крах дпочтительно картофельный тигается гидролиз О микробиои включает путем куль н на крахарительно ном с поентон, ния крахощью деких ферретение относитсякой промышленностиполучения биомассыания микроорганизмржащем сырье, предином и гидролиэовамилолитических Ферстен способ раэжижржащего сырья с погенных амилолитиче Иченное разжиженноеролиэа может бытькультивирования ми сле гид ино для кмов.Наиболее блитехническим решполучения биомапредусматривающгидролиэ крахмныращиэание дромассы С 21 .Недостатком известного способявляется невысокий выход биомассв процессе выращивания микрооргамов. Микроорганизмы утили и олигосахариды. Высоко ные углеводы, к числу к сится крахмал, перед вы микроорганизмов гидроли щью амилолитических оса ферментов и получают см Эту смесь используют в точника углерода. Интен дролиэа крахмала нозрас крахмалсодержащее сырье лизам подвергают разжиж литическими декстриноге т эируют моно- лекулярторых отноащиванием зуют с помохаривающих есь сахаров. качестве иссинность гитает, если перед гидро. ению амило иными Жерменнии рН среди 4,0-7,0, температура30-45Выращивание осуществляют периодическим и непрерывным способом в несколько стадий на установке, состоя- ,щей из нескольких Ферментеров, соединенных последовательно. крахмал или отработанную жидкость спредприятий производства крахмала.Сырье, содержащее крахмал, маниок или другие сорта картофеля, измельчают, просеивают и смешивают сводой до определенной концентрациикрахмала в смеси, При использованиив качестве сырья отработанной жидкости с предприятий производства крахмала из сырья предварительно извлекают белок известными способами;рН суспензии крахмала доводят,до оп.ределенной величины и дббавляют внее декстриногенный фермент оС.-1-4-глюкан-глюкангидролазу, Ферментподается непрерывно в аппараты длядвухстадийного разжижения. При этом 15осмесь нагревают до температуры 85-88,Продолжительность процесса разжижениясоставляет от 60 до 90 мин.Разжиженная масса раэбавляетсяводой до содержания сахара 1-8, 20предпочтительно 4. Затем в смесьдобавляют необходимые количестванеорганических питательных солей, содержащих азот фосфор, магний и калий,Доводят рН полученной питательнойсреды до 4,6-6.В качестве источника азота используют одно или несколько неорганических соединений: сульфат аммония,Фосфат аммония и нитрат аммония. Внекоторых случаях используют органи- ЗОческий азот в виде мочевины. В качестве других источников питания микроорганизмов используют дигидрофосфаткалия, гидрофосфат натрия, сульфатмагния, а также сульфат двухвалентного железа. Полученную питательнуюсреду стерилиэуют,при температуре120-135 под давлением в течение 1060 мин,Стерильная питательная средапоступает в Ферментеры и инокулируетсяМикроорганизмами; дрожжами,. бактериями или другими микроорганизмами,предпочтительно дрожжами родаСапада, синтезирующими белок,или 4дрожжами рода ВЬодосогц 1 а, синтезирующими предпочтительно липиды,Одновременно с инокулятором в ферментерыдобавляют необходимое количествосахарогенной амилаэы, предпочтительно глюко-амилазы, Фермент добавляютв стерильных условиях, В Ферментерепроходит одновременно осахариваниеразжиженного крахмала и рост микроорганизмов, Микроорганизмы используютдля роста образующиеся глюкозу и маль, тоэу,Раствор сахарогенной амилазыу 1 цсцгуее Н (Фирмы "Амано Сейияку",Япония) стерилиэуют пропусканиемчерез микроФильтр с размером пороколо 0,2 мк, например Фильтр ЕХИ 111 роге Фирмы "Миллипор Корп",С 1 ПА. Затем амилазу подают в среду.Выращивание микроорганизмов проводятв аэробных условиях при перемешива- Я Время выращивания дрожжей в питательной среде, содержащей разжиженный крахмал, который непрерывно осахаривают сахарогенной амилазой, составляет 14-21 ч, Биомассу отделяют от среды сцеживанием или центрифугированием. Затем биомассу сушат. Выход биомассы составляет 45-52 от .введенного сахара. Количество неиспользованного сахара составляет 0,10,2,На фиг.1 представлена технологическая схема предлагаемого способа,на Фиг,2 и 3 - примеры реализациистадии ферментативного осахариванияи выращивания культур.Способ включает следующие технологические стадии: предварительнаяподготовка исходного сырья 1 Ферментативное разжижение крахмала 2,получение питательной среды для выращивания культуры 3, стерилизацияпитательной среды 4, Ферментативноеосахаривание и выращивание культуры5, отделение микробных клеток б,сушка 7 и получение готового продукта 8.г Установка для ферментации (см. фиг.2) содержит три Ферментера 9-11, расположенные последовательно.Объем третьего Ферментера в два раза больше объема первого или второго ферментеров. Среда для выращивания культуры поступает через трубопровод 12, а сахарогенная амилаза через трубопровод 13. Три Ферментера последовательно связаны при помощи трубопроводов 14 и .15. Часть среды для выращивания культуры возвращается из второго Ферментера в первыйчерез трубопровод 16. Количество возвращаемой среды определяется скоростью роста используемых микроорга-. низмов, эффективной емкостью Ферментеров, концентрацией микроорганиз-, мов, а также концентрацией и количеством среды для выращивания, поступающей в ферментеры.Часть среды для выращивания культуры из второго ферментера возвращается в первый длятого, чтобы привить в первом Ферментере культуру микроорганизмов с высокой скоростью роста. Этим добиваются стабилизации концентрации микроорганизмов в первом Ферментере.Приэтом, предотвращается возникновениеявления так называемого,"вымывания"клеток, если в первый Ферментер будет поступать большее количествосреды для выращивания культуры. ВнепрерыВном многостадийном процессевыращивания возврат среды осуществляется из последнего аппарата.В непрерывной системе трехстадийного выращивания, в первом Ферментере наблюдается рост активности микро.организмов и ускорение процесса осахаривания. Во втором Ферментере находятся микроорганизмы в логарифмической Фазе роста. В третьем аппарате микроорганизмы находятся в стационарной Фазе роста.Благодаря ассимиляции сахара в последнем Ферментере значительно снижается биологическая потребность в кислороде отработанной водной средыУстановка для ферментации (см.Фиг.З) состоит также из трех 4 ерментеров 17-19, расположенных последовательно, как и в установке, представленной на Фиг,2, но со значительно улучшенными показателями процесса ферментации. Процесс выращивания аэробных микроорганизмов требует аэрации среды. Это приводит к образованию обильнойпены. Кроме того, меласса, отработанный раствор крахмала или отработанные эффлюенты пищевой промышленностисодержат вспенивающие вещества, вызывающие обильное образование пены. Поток жидкости из первого ферментераво второй или поток жидкости из второго Ферментера в третий содержат пену и пузырьки воздуха, что делает этот пбток нестабильным. Колебания скорости потока и скорости разбавления в известных системах непрерывного действия с перетоком или системахс рециклом приводят к нарушению развития микроорганизмов и нежелательному снижению выхода продукта.Установка для Ферментации, показанная на Фиг.З, предназначена для преодоления пенообраэования, Она отличается тем, что между первым,вторым и третьим Аерментерами поддерживается перепад давления. Процесс непрерывного выращивания аэробных микроорганизмов протекает спокойно. Уровень жидкости в ферментерах легко балансируется регулированием пере-.,- пада давления Р и Р в ферментсах 17 и 18 и Р и Р. в ферментерах 18 и 19. Если уровень жидкости в первом аппарате начинает повышаться иэ-за сильного образования пены, его можно снизить при помощи небольшого увеличения уровня давления Р . При этом, одновременно несколько увеличивается давление Р и Р.Этим добиваются стабильного протекания непрерывного выращивания культуры.Ферментеры связаны между собой трубопроводами 20 и 21. Исходный материал загружают через вход 22 в первый Ферментер. Воздух подают через трубопровод 23 в каждый аппарат-ных солей, рН доводили до 4, 4-5:Полученную среду для выращиваниякультуры непрерывно стерилизовали 5 1 О 15 20 25 ЗО 35 40 50 55 бО и выходит через отверстие 24. В пер"вом ферментере поддерживают давление1000-2500 мм водяного столба, во втором 600-1800 мм .водяного столба и втретьем 300-1500 мм водяного столба.Если необходимо, давление в первомферментере можно поднять выше2500 мм вод.столба,Небольшое повышение давления ваппаратах увеличивает скорость переноса кислорода, что приводит к увеличению скорости роста микроорганизмов и увеличению производительностипроцесса.Нри непрерывном выращивании дрож"жей рода Сапйоа в среде, содержащей неорганические питательные солии источник углерода, приготовленныйиз сельскохозяйственных продуктов,в установке для ферментации, представленной на фиг.З, выход биомассысоставляет 50 и более в пересчетена общие затраты сырья.Биомассу отделяют от отработаннойсреды сцеживанием, затем концентрируют на центробежном сепараторе сжиклером или на других сепараторах.Далее биомассу высушивают на распылительной сушилке, барабанной сушилке или в аппарате мгновенного испарения, В некоторых случаях можноиспользовать сушки специального типа с целью получения продукта в виде гранул или таблеток. Способ позволяет обрабатывать большие количества исходного материала в течение короткого промежутка времени.Процесс выращивания микроорганизмовпротекает спокойно. Контроль за течением процесса осуществляется автоматически. Можно перерабатывать исходный материал высокой концентрации.Так как Ферментативное осахариваниеи выращивание микроорганизмов осуществляется одновременно, то в дополнительной емкости для осахариваниянет необходимости. Предварительноеразжикение способствует увеличениюскорости гидролиэа. Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1 . Корни маниоки(тапиока) измельчали и разбавляливодой до образования кашицы с содержанием крахмала примерно 16,рН кашицы доводили до 6,0-6,2, добавили декстриногенный Фермент(Спи 1 аз К, Фирма Нагаэе ИндастриэлКорп, Япония) в количестве 0,2 впересчете на содержание крахмала.Кашицу непрерывно раэжижали притемпературе 85-88 С. После удаленияпримесей разжиженный раствор разбавляли водой до концентрации сахара1,5-6.В раствор добавляли необходимоеколичество неорганических питательнагреванием в стерилизаторе, а затем подавали в первый ферментер,Среду инокулировали культуройСаодда ес 11 ь. Одновременно и непрерывно в среду для выращивания сзаданной скоростью добавляли в стерильных условиях сахарогенную амилазу.Общее время выращивания составило4-8 ч,Биомассу отделяли при помощи центрифуги и высушивали. Выход сухихмикробных клеток составил 45-53 впересчете на содержание крахмала втапиоке.П р и м е р 2, Корни маниоки(тапиоки) обрабатывали и разжималитем жеспособом, что описан в примере 1. Разжиженный раствор разбавляли водой, так чтобы содержание крахмала составляло 4. В раствор добавляли необходиМое количество неорганических солей, таких как неорганические соединения азота, Фосфора,калия и другие. Раствор стерилизовали при помощи нагревания и непрерывно подавали в Ферментер, Среду инокулировали дрожжами 5 ассЬагоеусеьсегечьа 1, Одновременно в стерильных условиях в среду добавляли0,3-0,5 сахарогеннрго Фермента впересчете на общее содержание сахарав среде. Время выращивания составило 6-10 ч,Клетки дрожжей отделяли,концентрировали и сушили. Выход клеток дрожжей составил 45-50 в пересчете навес крахмала.П р и м в р 3. Отработанный эфФлюент с предприятия по производству картофельного крахмала (содержание сухих веществ около 8, содержание растворимых веществ, не содержащих азота, 3-4) обрабатывали дляполучения рН, равного б. Затем массу разжижали добавлением заданногоколичества разжижающего Фермента.Затем в раствор добавляли необходимоеколичество неорганйческих питательных солей и получали. среду для выращивания культуры. Среду стерилизовали нагреванием и непрерывно подавали в Ферментер. Выращивали дрожжирода Сапдда, В среду в стерильныхусловиях с заданной скоростью непрерывно добавляли сахарогенную амилазу, После выращивания клетки дрожжей отделяли от среды, концентрировали и сушили. Около 45 растворимых,не содержащих азота, веществ переходили в клетки дрожжей.П р и м е р 4. Сырые корни маниоки обрабатывали и разжижали по аналогии с примером 1. Разжиженный раствор разбавляли так, чтобы концентрация сахара составляла 2-5. Враствор добавляли необходимые неорганические соли. В полученной средедля выращивания культуры соотношениеконцентрации С/Ц составляло 20-.49:1. Среду стерилизовали и подавали вФерментер. Осуществляли периодическое или непрерывное выращивание дрожжей, рода 1 Ьодо 1 огц 1 а, которыепродуцируют липиды. Одновременно встерильных условиях в среду добавляли с заданной скоростью сахарогенную амилазу. После отделения й концентрирования биомассу высушивали.Выход сухих клеток составил 40-48в пересчете на содержание крахмалав сырой маниоке. Содержащие липидовв сухих клетках дрожжей составило15-50.Липид имели состав, аналогичныйсоставу растительного масла. Кроме35 того, остаток, образовавшийся послеизвлечения липидов, представлял собой массу, богатую белками.П р и м е р 5. Непрерывное выращивание микроорганизмов проводилиЯ на установке для аэробной Ферментации, представленной на Фиг,3. Давление в первом Ферментере составляло1800 мм водяного столба, во втором -1500 мм водяного столба и в третьем1000 мм водяного столба. Интенсивность аэрации была в первом ферментере 0,5 об/об мин, во втором -1,0 об/об мин и 0,5 об/об мин - втретьем ферментере.Общий объем первого, второго итретьего Ферментеров составлял500 л, 500 л и 1000 л, соответственно. Объем среды для выращиваниякультуры составлял 300 л, 300 л и600 л соответственно. Скорость подаЫ чи среды была 250 л/ч, Использовалидрожжи Сапдда деполь, Среда для выращивания культуры содержала следующие неорганические соли: МН МО- б г,КНРО;- 3 г, МаНРО 4,12 Н О - 0,5 г,40 Мд 5047 НО - 0,5 г Ге 5 о 4- 0 5 г,водопроводная вода - 1000 мл, рН 5,5.В качестве источника углерода использовали раствор, полученный измельчением и разжижением сырого сладкого4 Я картофеля, который добавляли в средутак, чтобы концентрация глюкозы была 4, рН среды поддерживали на за-,данном уровне при помощи МНОН. Длительность непрерывного выращиваниящ 0 в три стадии составляла 500 ч, Выходбиомассы был 50 в пересчете на источник углерода, а скорость ростадрожжей равнялась 0,6 ч,П р и м е р б. Для выращиваниякультуры использовали среду, составкоторой приведен в примере 5. В качестве источника углерода в средудобавляли мелассу с концентрацией 4(в/в) в пересчете на сахар, Осуществ.ляли непрерывное выращивание штамма40 дрожжей Сапдда ей 1 ь. В первом,втором и третьем Ферментерах поддерживали давление 2500 мм вод.столба(Р), 2000 мм вод,столба (Р ) и3500 мм вод,столба (Р 3) соответственб 5 но. При этом интенсивность аэрации/2 ВНИИПИ Заказ 8892/66 Тираж 522 Подпис Филиал ППП Патент, г, ужгород, ул. Проектная,были 1,0 об/обмин, 1,0 об/об мин и 0,5 об/обмин соответственно. Непрерывный способ выращивания в три стадии осуществляли с использованиеМ установки для ферментации, представ. ленной на фиг.З.Размеры ферментеров и количество среды, загружаемой в каждый, аналогичны размерам и количествам, приводимым в примере 5.Непрерывное выращивание осуществляли в течение более 300 ч. Выход микробных клеток составил 52 в пересчете 1 О на содержание сахара.П р и м е р 7, Для выращивания культуры использовали неорганическую среду, имеющую состав, аналогичный приведенному в примере 5. В качестве 3 источника углерода использовали отработанный раствор картофельного крахмала. Выращивали культуру бапд 1 да цй 111 э. Источник углерода имел концентрацию 4. 20Непрерывное выращивание протекало при тех же условиях, что описаны в примере 6, в течение 400 ч и более беэ каких-либо трудностей, вызванных загрязнением среды другими микроорганизмами. Выход микробных клеток составил 48 в пересчете на концентрацию сахара. Содержание белка в микробных клетках составило 46-52.П р и м е р 8. В качестве источника углерода использовали мелассу. ЗО Выращивали дрожжи КЬодо 1 огца дгас 1115, вырабатывающие липиды. Концентрация источника углерода составляла 4 (в/в). Неорганическая среда для выращивания содержала 35 75 мг/л мочевины и 25 мг/л КН 2 РО, рН среды было равно 5,0.Интенсивность аэрации составляла 5,0 об/обмин. Непрерывное выращивание дрожжей осу-ществляли при температуре 32 фС. Среду перемещали со скоростью 200 об/мин,Выращивание проводили на установкедля ферментации представленной нафиг.З.В первом, втором и третьем ферментерах поддерживали давление,мм вод.столба: 1200, 800 и 500 соответственно. В результате непрерывного процесса выращивания в течение250 ч содержание липидов достигало39,6 в пересчете на сухие клеткидрожжей. 1. Способ получения биомассы микроорганизмов, предусматривающий фер".ментативный гидролиз крахмалсодержащего сырья, выращивание дрожжей иотдельные биомассы, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода биомассы, перед Ферментативным гидролиэом крахмалсодержащее сырье разжижают путем добавлениядекстриногенного фермента ( -1-4-глюкан-глюкан-гидролазы, полученнойиэ Вас 1 цэ эцЬс 11 чаг В 1 ойесцэ,а выращивание дрожжей осуществляютнепосредственно в процессе ферментативного гидролиза сырья.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что культивируютдрожжи видов ап 01 да ц 111 ь илиРЬодойогц 1 а дгас 111 с.Источникиинформации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент СШй 1 3149049,кл. 195-31, опублик,1964.2. Патент Франции Р 2285080,кл. С 12 0 13/06, опублик.1976