Способ выделения антигена 8 возбудителя мелиоидоза

НИК ИЗОБРК Я ПАТЕНТУ Комитет Российской Федерации о патентам и товарным знакам(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 8 ВОЗ(19) И 1 (11) 200(57) Использование: медицина, иммунологические исследования. Сущность изобретения: исходную антигенную смесь пропускают через колонку с монокпональными антитепами против антигена 8 воз - будит ел я мелиоидоза конъюгированными с СМВг-сефарозой 4 В в течение 120 - 150 мин при концентрации антител 2 - 9 мг/мл геля с последующей десорбцией антигена глицин йаОН буфером, рН 10,5 - 11,0. 1 ил 1 табл.Изобретение относится к медицине икасается получения высокоочищенного антигена возбудителя мелиоидоза, антигена 8 (АГ 8).Известны различные способы выделения антигенных комплексов из микробных клеток возбудителя мелиоидоза. Так, выделе. ны и охарактеризованы полисахаридсодержащие комплексы иэ целых клеток и клеточныхстенок Рзецсоаопаз рзецбоваИе 1, Методы выделения поверхностных полисахаридов из микробных клеток основаны на экстракции их органическими растворителями.Наиболее близким является способ получения мелиоидозного полисахаридного антигенного комплекса, обогащенного АГ 8, пригодного для иммуннохимических и иммунологических исследований. Способ представляет собой формамидную экстракцию полисахаридного антигенного комплекса из обезэараженных ацетоном клеток Р.рзецсотаИе 1. При обработке микробных клеток формамидом возможна определенная степень деградации выделяемого антигена.Оптимизация температурного режима обработки клеток формамидом уменьшает эти негативные воздействия и повышает степень антигенного комплекса, обогащенного АГ 8, Однако получение гомогенного препарата данным способом чрезвычайно сложно, Нередко требуется дополнительная очистка АГ 8.В тоже время проведение иммунохимических и иммунологических исследований требует наличия стандартов антигенов, соответствующих антигенной схеме возбудителя мелиоидоза, максимально сохранивших структурные и биологические свойства соответствующих биополимеров микробной клетки.Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта - антигена 8 возбудителя малиоидоза.Цель достигается тем, что смесь водорагтворимых антигенов Р. рзецботаИе подвергают аффинной хроматографии на колонке с моноклональным иммуносорбентом. Иммуносорбент готовят путем конъюгирования активированной СКВг-сефарозы 4 В с моноклональными антителами.(МКА) мм Р ргл. Штамм-продуцент МКА депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК276 Д.По заявке на штамм гибридомы мм Р рп- М 4864957/13 получено положительное решение от 29,06.90 г.Иммуносорбент готовят на основе коммерческой СКВг-активированной сефарозы 4 В. Активацию сефарозы 4 В можно проводить в лабораторных условиях. В этом случае непосредственно перед опытом гель 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 обрабатывают бромцианом, разведенным ацетонитрилом, из расчета 0,2 г бромциана на 1 мл геля. Затем свежеактивированный гель быстро переносят на воронку со стеклянным фильтром и промывают с отсасыванием ледяной дистиллированной водой и охлажденным 0,1 М бикарбонатным буфером, рН 8,2, в течение 60 с. После отмывания гель быстро переносят в колбу с раствором МКА против АГ 8, разведенных на 0,1 М бикарбонатном буфере с 0,5 М йаС рН 8,2, до концентрации 9-10 мг антител на 1 мл геля. Смесь инкубируют в течение 120 мин и более при рН среды 8,5. Готовым моноклональным иммуносорбентом заполняют хроматографическую колонку, через которую пропускают исследуемую смесь антигенов возбудителя мелиоидоза, диализованную против забуференного 0,15 М раствора ИаС 1 рН 7,2. Несвязавшиеся с МКА компоненты смеси вымывают из колонки этим же раствором, а затем производят десорбцию специфического антигена (АГ 8) 0,1 М раствором МаОН -глицинового буфера, рН 10,5-11,0.Очищенный таким способом АГ 8 иммунохимически гомогенен и серологически активен, Г 1 о химическому составу он представляет собой гликопротеин с содержанием белка 10;4 и полисахаридов 904. Количество выделяемого АГ 8 зависит от объема сорбента и величины колонки, нагрузки исходной анти- генной смеси на сорбент и от удельного содержания АГ 8 в исходной смеси.П р и м е р 1, Изучение динамики связывания МКА против АГ 8 с активированной се Фа розой.Скорость связывания МУА с носителем определяли в течение 4 ч по изменению исходной. концентрации белка в супернатанте реагентной смеси. Через 15-20 мин происходило 50;4, через 60 мин - 75-80;4, через 120 мин - 907 связывание, В последующие 2 ч присоединения МКА к сорбенту было незначительным. Поэтому оптимальное время коныюгирования МКА с активированным гелем - 120-150 мин, а количество связанных с носителем МКА - 2-9 мг на 1 мл геля.П р и м е р 2, Подбор условий десорбции АГ 8. После нанесения исходной антигенной смеси на колонку и вымывания всех несвязавшихся компонентов приступают к разрушению связи АГ-АТ и элюированию с колонки ЛГ 8. Для десорбции различных биополимеров, как правило, применяют глицерин-НС 1, рН 2,2-2,8, В опыте 0,1 М глицеин-НС буфер, рН 2,8, также оказался эффективным десорбирующим агентом. Однако было отмечено, что под его воздействием сникается АГ-связывающая активность2004251 Сводная таблица данных по очистке АГ 8 методом аффинной хроматографии. иммуносорбента и он становится непригодным для многократного повторного использования. Применение глиц,ин-йаОНбуфера, рН 10,5-11,0 во всех случаях обеспечивало эффективное выделение АГ 8 и невлияло на АГ-связывающую активность иммобилизованных на носителе МКА. Многократное применение (три и более раз)иммуносорбента было продемонстированово всех опытах по получению высокоочищенного антигена.Таким образом оптимальным десорбирующим агентом признан глицерин-ИаОНбуфер, рН 10,5-11,0.П р и м е р 3. Изучение диапазона возможных источников выделения АГ 8.Для выделения АГ 8 использовали различные антигенные смеси: водно-солевыеэкстракты, формамидные экстракты и экстрацеллюлярные антигены. В таблице представлены данные по очистке АГ 8,Установлено, что выход АГ 8 зависит отнагрузки на колонку и от насыщенности этимАГ исходного материала. Так, при относительно небольшом содержании суммарного количества сахаров удельная концентрация АГ 8 вЭЦА максимальна, Менее насыщенным АГ 8являются водно-солевой и формамидный экстракты. Поэтому при использовании последних в качестве источника АГ 8 следуетувеличивать нагрузку на колонку исходнойантигенной смеси, а при препаративном получении АГ 8 наиболее пригодным исходнымматериалом является ЭЦА.Гомогенность и идентичность образцовАГ 8, полученных в опытах, представленных. в таблице, была подтверждена с помощьюреакции иммунодиффузии в геле и иммуноэлектрофореза с гипериммунной поликлональной сывороткой.П р и м е р 4, Сравнительная оценкаиммунохимической гомогенности антигенных препаратов, приготовленных различными способами,Антигенный состав различных препаратов, приготовленных с помощью водно-солевой, формамидной экстракции, ионообменнойи аффинной хроматографии, изучали с помощью иммуноэлектрофореза с гипериммунной поликлональной козлиной сывороткой против антигенов возбудителямелиоидоза (см. чертеж), На чертеже пока 5 вана Иммунофореграмма антигенов Р.рзеобоаае , выделенных различнымиметодами.1,5- В СЭ, приготовленный в результатеклеток ультразвуком. Концентрация - 310 мг/мл,2 - формамидный экстракт, Концентрация - 12,5 мгlмл.3 - АГ, приготовленный после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе15 А. Концентрация - 12,5 мг/мл.4 - АГ 8 очищенный методом аффиннойхроматографии с помощью иммобилизованных на сефарозе МКА против данного АГ.Концентрация - 5 мг/мл,20 В продольные канавки внесена гипериммунная козлиная сыворотка против клеток Р,рзевбовае 100.Иммунохимическая гомогенность АГ 8зарегистрирована при выделении его с по 25 мощью моноклонального иммуносорбентаметодом аффинной хроматографии.Таким образом, предлагаемый способочистки АГ 8 возбудителя мелиоидоза с помощью моноклонального иммуносорбента30 позволяет выделять из различных антигенных смесей иммунохимически гомогенныйАГ 8, пригодный для последующего использования в иммунохимических и иммунологических исследованиях.35(56) Захарова И.Я., Косенко Л,В, Изучениемикробных полисахаридов. Киев, Науковадумка, 1982, с. 25-26.Журнал микробиология, эпидемиология40 и микробиология, 1981, М 4, с. 78-82.Пивень Н.Н., Смирнова В.И, Выделение, очистка и химический состав поверхностного полисахаридного антигенногокомплекса возбудителя мелиоидоза. В кн:45 Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей, Сб, науч,работ, Волгоград, 1989, вып. 4, с. 111-117.(мг/мл) Выхо саха ов мг 6,34 0,34 Р. рзецбоваИе 56830лярный антиген Водно-солевойэкстрактФормамидныйэкстрактЭкстрацеллюлярный антигенЭ кстрацеллюлярный антигенФормамидныйэкстрактВодно-солевой Формула изобрете н ия СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 8, ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА из анти- генной смеси, отличающийся тем, что; сцелью повышения чистоты антигена, анти- генную смесь пропускают через колонку с Продолжение таблицы сорбентом СМВг-сефароза 4 В, коньюгированная с моноклональными антителами против антигена 8 мелиоидоза, в течение 120 - 150 мин при концентрации антител 2 9 мгlмл геля с последующей десорбцией антигена глицин-йаОН буфером, рН 10,5- 11,0,2004251 Составитель О. ШановаРедактор В. Трубченко Техред М,Моргентал Корректор Н. Король Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Заказ 3363 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101