Способ моделирования аллергических состояний у экспериментальных животных

(5)5 6 09 В 23/ ИЯ В.Гончаров,(пипо 1, 1983,ИЯ АЛЛЕР- СПЕРИМЕНгде+СН-СН), - 6 -10% С СНН) -бО/ рименпособу х живорые хаовнем класса ЫюгеСАСНН)- - 5- 1(% повы- ллер- льных ется в м вво- ванные,00 олимеры И-цети пиридиний-броми где (-0 ННб ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(72) А.Н.Попов, А.А.Бабахин, ВМ.И,Мустафаев и И,С,Гущин6) пав. Агсйв, АПегцу, Арр, гп72, рр, 199-205.4) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ У ЭКТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к экспе т льной аллергологии, в частности к оделирования у экспериментальны трых аллергических состояний, кото рактеризуются повышенным ур сывороточного иммуноглобулина 1:(9 Е). Цель изобретения - упрощение аение эффективности моделировани гйческих состояний у эксперимент хивотных,Поставленная цель достигается гаемым способом, который заключ тм, что экспериментальным животн дт модельный аллерген и кватернизо(57) Использование: экспериментальная аллергология, в частности способы моделирования аллергических состояний у экспериментальных животных. Сущность изобретения: экспериментальным животным вводят модельный аллерген в присутствии адъюванта, в качестве которого используют кватернизированные сополимеры П-цетил и П-этилполи-винилпиридиний бромидов М М.200000 - 220000 в дозе от 5 до 50 мг/кг массы животного, Способ прост в исполнении, позволяет эффективно моделировать аллергические состояния узкспериментальных животных,ММ. 200000-220000;0 аеНв дозе 5 - 50 мг/кг массы животного,Отличием способа является использование в качестве адъюванта кватернизованных сополимеров М-цетил и М-этиполи-винилпиридиний бромидов вышеуказанной общей формулы в дозе 5 - 50 мг/кг массы животного, Используемые сополимеры не требуют предварительного смешивания с антигеном и действуют при одновременном с ним введении. СП различного состава и с разной степенью полимеризации получены ранее и охарактеризованы физико-химическими методами исследова 1803928ний. Известно, что они проявляют в отношении иммунокомпетентных клеток митогенные свойства. Использование их в качестве адъювантов для индукции дЕ ответа неизвестно.Для достижения цели предполагаемого изобретения необходимо вводить животным СП в дозах 5-50 мг/кг. Введение СП в дозе менее 5 мг/кг усиления продукции дЕ специфических антител не вызывает, Применение доз более 50 мг/кг не целесообразно, так как дальнейшего усиления синтеза 9 Е антител не происходит.Основой для получения СП служит поли- винилпиридин с молекулярной массой 97 кД. После кватернизации поли-винилпиридина цетилбромидом полученный продукт доалкилировали бромистым этилом. Сополимеры представляют собой лиофильно высушенные порошки, хорошо растворимые в воде, Препараты легко дозируются путем приготовления водных растворов определенных концентраций. После полного растворения препаратов СП (4-6 ч при комнатной температуре или 15 мин при 37 С) рН их водных растворов доводят до 7,0 1 Н чаОН. Перед иммунизацией растворы СП стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкн, В лиофильно высушенном состоянии препараты СП хорошо хранятся и (по нашим данным) по крайней мере в течение 3 лет не теряют своей адъювантной активности, Все эти качества делают их гораздо более удобным в экспериментальном использовании по сравнению с ПАФ, МГ, личинками гельминтов или солями ртути, Выбор в качестве модельного аллергена овальбумина (ОА) обусловлен его способностью при введении экспериментальным животным индуцировать специфический дЕ ответ и широким использованием в экспериментальной лабораторной практике. Используемая для введения доза модельного аллергена ОА традиционна для подобного моделирования дЕ ответа у экспериментальных животных.Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию "существенные отличия" показала, что ни в патентной ни в научной литературе не выявлено совокупности признаков, указанной в формуле изобретения.Примеры осуществления способа.П р и м е р 1. Испытана способность СП индуцировать специфический 9 Е ответ в эксперименте на мышах (СВА х С 57 В 1/6)Р 1 массой 18 - 20 г. В каждую экспериментальную группу брали по 8 - 10 мышей, СП, содержащий 5 моль% звеньев цетилбромида 5 10 15 20 25 30 35 40 45 на 1000 мономерных звеньев винилпиридина (СП 5) с молекул, массой 205 кД вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 0,25; 0,5;2,5; 5; 25 и 50 мг/кг массы тела, ОА также инъецировали внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг. Мышам контрольных групп инъецировали один ОА, ОА, эмульгированный в 0,2 мл ПАФ, или ОА, адсорбированный на 2,5 мг МГ, который получали по ранее описанной методике (3, На 21 день после иммунизации мышей всех групп вторично иммунировали одним ОА в дозе 0,5 мг/кг, Влияние введения различных адъювантов на развитие специфического 9 Е ответа оценивали по уровню анти-ОА гомоцитотропных антител в сыворотке иммунизированных мышей. Кровь на определенные сроки после иммунизации получали от каждой мыши индивидуально из ретробульбарного венозного сплетения, Сыворотку от сгустка форменных отделяли центрифугированием. Смешивая одинаковые объемы индивидуально полученных сывороток внутри каждой экспериментальной группы, получали пул сывороток, который затем тестировали в реакции пассивной кожной анафилаксии. Титры дЕ и 96 гомоцитотропных антител в пуле сывороток мышей одной группы определяли по стандартной методике 7, 15, 16 на 5 беспородных крысах-самцах массой 200 - 260 г или 5 беспородных мышах-самках массой 18 - 22 г соответственно, Животным под эфирным наркозом строго внутрикожно (крысам на животе, мышам на спине) вводили микрошприцем по 30 мкл последовательных двукратных разведений пулов сывороток, приготовленных на 0,9% растворе ИаС, Разрешающую дозу ОА вводили под эфирным наркозом в хвостовую вену крысам через 24 - 48 ч (100 мкг/100 г массы в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса), мышам через 2 ч (500 мкг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса), Через 30 мин животных под эфирным наркозом декапитировали и учитывали результаты реакции пассивной кожной анафилаксии на внутренней стороне кожи живота или спины соответственно. За титр гомоцитотропных анти-ОА антител в тестируемом пуле сывороток принимали последнее из его разведений, дающее прокрашивание участков кожи в местах внутрикожных инъекций размером не менее 5 мм в диаметре. Результаты выражали в логарифмах по основанию 2 величин, обратных титрам гомоцитотропных антител в реакции пассивной кожной анафилаксии, и брали среднее арифметическое значение, полученных на 5 животных, При статическом анализе достоверности различий в титрах гомоцитотропных антител междугруппами использовались эмпирическимправилом, предложенным рядом исследователей 16). Различие считали достоверным при разнице величин более чем на 3шага разведения и тогда, когда разница в 2 шага воспроизводилась минимум в 3 независимых экспериментах,В табл, 1 представлены результаты определения уровня анти-ОА 1 д Е ответа, индуцированного у мышей внутрибрюшиннымвведением ОА вместе с различными адъювантами,Как свидетельствует из таблицы введение мышам совместно с модельными аллергеном СП в зависимой от дозы степенииндуцирует у мышей достоверное повышение сывороточного уровня специфичных ковальбумину 1 д Е антител. Эффект введения СП в дозах 5-50 мг/кг массы на уровеньпервичного 19 Е ответа сопоставим с действием других адъювантов: ПАФ и МГ,П р и м е р 2, Испытана способность СП различного состава индуцировать специфический 1 дЕ ответ в эксперименте на мышах (СБА х С 57 В 1/6)Р 1 массой 18 - 20 г, Использованы СП, содержащие 5, 7 и 14 мольф звеньев цетилбромида (СП 5, СП 7 и СП 14, соответственно), СП в разных дозах вводили вместе с модельным аллергеном ОАвнутрибрюшинно. Использованные при первичной иммунизации мышей дозы СП, 0 А и результаты определения уровня анти ОА 19 Е антител представлены в табл,2,Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что С 1 разного состава также способны усиливать продукциюдЕ антител. Интересен тот факт, что при введении очень больших доз модельного аллергена (50 мг/кг), не способствующих развитию дЕ ответа, совместное введение СП 14 способствует продукции анти-ОА 19 Е антител.П р и м е р 3. Оценка влияния эффективности различных способов введения СП на его способность индуцировать продукцию дЕ антител. Мышей(СВА х С 57 В 1/6)Р массой 18 - 20 г иммунизировали ОА в дозе 50 мкг/мышь, Вслед за инъекцией антигена 5 1020 2530 35 40 45 50 СП оценивали по титрам анти-ОА 19 Е гомоцитотропных антител, определяемых в пуаднои группе мышеи внутрибрюшинно вводили 0,2 мл СП в дозе 5 мг/кг, а другой - такую же инъекцию СП делали подкожно в загривок. В контрольных группах вслед за инъекцией ОА мышам внутрибрюшинно или подкожно вводили физиологический раствор йаС 1, 0,2 мл эмульсии ПАФ или 0,2 мл, содержащие 2,5 мг МГ, На 21 день после иммунизации мышей вторично иммунизировали одним ОА в дозе 0,5 мг/кг. Эффективность того или иного способа введениялах сывороток крови мышей как описано в примере 2, Результаты определения титров специфичных 1 дЕ антител у мышей разных групп представлены в табл.3,Представленные данные свидетельствуют, что использованный в качестве адъюванта СП эффективно стимулирует продукцию специфичных 1 дЕ антител даже при раздельном введении с модельным аллергеном,Приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемые СП имеют преимущества по сравнению с другими адъювантами, используемыми в экспериментальной практике для индукции 1 дЕ ответа, СП не токсичны, удобны в работе, действуют даже при раздельном введении с модельным аллергеном. При этом денатурации модельного аллергена не происходит. Все эти факторы делают предлагаемые СП более простыми и эффективными адъювантами для индукции аллергических состояний у экспериментальных животных, Формула изобретения Способ моделирования аллергических состояний у экспериментальных животных путем введения аллергена и адъюванта, о тл ича ю щийся тем,что,сцельюупрощения и повышения эффективности способа, в качестве адъюванта используют кватернизованные сополимеры Н-цетил и И-атил поли-винилпиридинийбромидов с общей структурной формулой: где+СН-СН),- б -10% (СН-СН) -60-85% 103СгН Н -СН)- - 5- 14%Нзмол.м. 200000 - 220000 в дозе от 5 до 50 м массы животного.1803928Таблица 1Титры анти-ОА 19 Е гомоцитотропных антител в сывороткекрови мышей после первичной иммунизации ОА с разнымиадъювантами и вторичной иммунизации на 21-й день одним ОАПримечание. Значком обозначены титры гомоцитотропных 19 Е антител к ОА. достоверно превышающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей.Таблица 2Титры анти-ОА 9 Е гомоцитотропных антител в сыворотке крови мышей после первичной иммунизации ОА с СП разногосостава и вторичной иммунизации на 21-й день одним ОАПримечание, Значком обозначены титры гомоцитотропных 19 Е антител к ОА, достоверно превышающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей,10 1803928 Таблица 3 Титры анти-ОАдЕ гомоцитотропных антител в сыворотке крови мышей иммунизированных первично ОА и после различных способов введения СП и вторично на 21-й день одним ОАСоставитель И. ГущинТехред М.Моргентал Корректо едактор Т. Козло евс Заказ 1058 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 СССР изводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 римечание. Значком обозначены титры гомоцитотропных 1 д Е антител к ОА, достоверншающие аналогичный показатель в контрольной группе мышей.