Способ получения иммуногемосорбента

(2 исследовательскии итут медицинской ашков, И,Л. Лир, кийМетод повышения ивированного углококковому ток- , 1979, М. 9, с. 546 -ГЕМ медицине, в ммуногемоявляется пой емкости и ммуногемоведенных испытаний в пом и контролями приГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Всесоюзный научнои испытательный инсттехники(56) Карлин Н.Н, и др.сорбционной емкости актля по отношению к стафисину, - Лабораторное дело547.. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМСОРБЕНТА(57) Изобретение относится кчастности к способу получениясорбента. Целью изобретениявышение удельной сорбционнспектра иммуноглобулинов. И Изобретение относится к медицине. в частности, кспособу получения иммуногемосарбента."Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра наносимых на матрицу иммуноглобулинов, которые после иммобилизации могли бы служить. лигандом иммуногемосорбента.П р и м е р 1, Готовят рабочий раствор сыворотки кровичеловека иэ расчета 1 часть сыворотки и 3 части физиологического раствора, Полученный раствор, взятый в обьеме 100 см, подвергают униполярной катодной3бработке в проточном режиме в описвном выше устройстве при силе тока 50 мА. сорбент получают путем нанесения иммуноглобулинов на матрицу, для чего через нее перфуэируют водный раствор иммуноглобулинсодержащей сыворотки, подвергнутый обработке в катодной камере при силе тока 50-60 мА в течение 30 - 40 мин. Использование изобретения позволяет повысить удельную сорбционную емкость и спектр наносимых на матрицу иммуноглобулиновболее чем в два раза, причем позволяет наносить иммуноглобулины сыворотки, минуя стадию их выделения, а после иммобилизации термическим способом придает иммуногемосорбенту способность адсорбировать антитела к иммуноглобулинам, Использование заявляемого способа в эксперименте на животных путем проведения маятниковой иммуногемосорбции позволяет повысить устойчивость животных к аллер- (у) гическому медиатору гистамину в три раза.1 ил, 4 табл. перфузируя этот раствор через 200 см гемосорбента.СКН - 4 М с помощью роликового насоса. Время рециркуляции раствора 30 мин. Обьемное соотношение пропускаемого раствора и матрицы равно 1:3.Обработанную таким образом матрицу освобождают от раствора, сушат, отмывают и используют для проведения исследований.Результаты просравнении с прототиведены в табл. 1 и 2,Использование заявляемого способа позволяет, по сравнению с прототипом, наносить на матрицу почти все классы иммуноглобулинов, что расширяет ассортимент10 15 20 25 30 35 40 50 55 наносимых антител. Причем, удельная сорбционная емкость гемосорбента (матрицы) относительно иммуноглобулинов при катодной обработке увелицивается более чем в 2 раза. Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять иэ сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве иммунолиганда,Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять из сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве иммунолиганда,П р и м е р 2. Выполнение лабораторного опыта иммуногемосорбции с использованием полученного иммуногемосорбента,Матрицу (готовый углеродный гемосорбент марки "ФАС" обрабатывают сывороткой крови человека согласно примера 1. После этого гемосорбент с нанесенными на него иммуноглобулинами отмывают от неадсорбированных белков с помощью физиологического раствора. Далее полученный сорбент подвергают термической обработке при температуре выше 100 С до полного высушивания, При такой термической обработке происходит фиксирование и денатурация нанесенных на матрицу белковых веществ (иммуноглобулинов), Полученный гемосорбент еще раз отмывают физиологическим раствором и используют для проведения испытаний,Гемосорбент после сливания физиологического раствора смешивают с равным обьемом содержащей антитела к определенному иммуноглобулину сывороткой(моноспецифической сывороткой), разведенной предварительно в 5 раз. Для контроля аналогичный обьем гемосорбента (ФАС), не подвергнутого модификации предлагаемым способом, смешивают в тех же соотношениях с моноспецифическими сыворотками, Испытывают адсорбционную способность опытного и контрольного образца сорбентов к имеющимся в наличии моноспецифическим сывороткам (анти, антиА, антиМ). С каждой антисывороткой для количественного выражения реэультатов адсорбции, ставят титрованную реакцию Манчини, причем, титруют не плазму человека, как общепринято, а саму анти- сыворотку, Делают разведения антисыворотки 1;5, 1:10, 1:20, 1.40. Каждое разведение пополам смешивают с расплавленным агаром и наносят по 3 мл на предметные стекла, На каждом стекле с агаром делают ряд лунок общепринятым методом, В каждую лунку вносят по 3 микролитра цельной сыворотки человека. Учет результатов производят на следующий день, через 18 часов. В результате получают ряд предметных стекол, для каждой антисыворотки, для каждого ее разведения свое стекло и каждому разведению антисыворотки соответствовал свой диаметр кольца преципитации. На основании соответствия разведения антисыворотки и квадрата диаметра преципитационного кольца вычерчивают калибровочную кривую, Имея такую кривую, легко установить, насколько уменьшается концентрация антител к конкретному иммуноглобулину после взаимодействия антисыворотки с контрольным гемосорбентом или иммуногемосорбентом, Исследование истощенных сорбентами моноспецифических сывороток производили после перемешивания их в аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 3,Результаты исследований, представленные в таблице, показывают, что после закрепления на матрице денатурированного иммуноглобулиносодержащего лиганда к присущей матрице способности изымать из сыворотки антитела к иммуноглобулину "О" присоединяется свойство адсорбировать ан-. титела к 1 цА. а также наиболее активно связывать и антитела к иммуноглобулину "М", причем зта способность выражена вдвое сильнее, чем к иммуноглобулину "6".П р и м е р 3, Выполнение иммуногемосорбции на кроликах с использованием полученного иммуногемосорбента,Готовят иммуногемосорбент согласно примера 1 и 2. Затем расфасовывают во флаконы, заливая небольшим количеством физиологического раствора, рН 7,0 и подвергают автоклавированию при 1,2 атм в тецение 1 часа, Для проведения контрольных опытов в качестве лиганда используют альбумин человека (10 О раствор), Особенность нанесения альбуминового лиганда на матрицу заключалась в том, что полярность электрического тока, используемого для обработки раствора альбумина,меняли на противоположную, Остальные операции проведены согласно примера 1 и 2. Гемосорбент (опытный и контрольный образцы) после сливания физиологического раствора промывают физиологическим раствором, содержащим гепарин (5 тыс, ед. на 100 мл эоаствора). Далее в шприц емкостью 10 см набирают 3 см гемосорбента, пунктируют краевую вену кролика и заполняют шприц до 10 мл кровью. После 10-минутного взаимодействия гемосорбента с кровью осуществляют возврат крови в вену животного,1797896 Таблица 1 Условия получения иммуносорбентовИммуносорбент получен без змктрообработки раствора сыворотки,Никаких патологических реакций после возврата крови не отмечается. Через 2 часа и ро веря ют устойчивость животных (оп ытных и контрольных) к смертельной дозе 0,1раствора гистамина гидрохлорида. Абсолютная смертельная доза этого медиатора для кроликов устанавливается в предварительных опытах. Она равнялась в наших опытах для кроликов весом 3 кг 2,1 мл внутривенно введенного раствора или 0,7 мл на 1 кг веса.Результаты испытаний гемосорбентов представлены в табл. 4.Результаты исследований, представленные в таблице, показывают, что предлагаемый иммуногемосорбент по сравнению с контрольным гемосорбентом с неиммуноглобулиновым белковым лигандом повышает устойчивость кроликов к смертельной дозе аллергического медиатора гистамина, что подтверждается трехкратным увеличением выживаемости животных, подвергнутых маятниковой иммуногемосорбции, от токсического медиатора гистамина.Использование заявляемого способа позволяет наносить иммуноглобулины на матрицу в достаточно большом количестве, минуя предварительную стадию выделения иммуноглобулинов иэ сыворотки, значительно увеличивает спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов, а пр. иммобилизации нанесенных иммуноглобулинов спомощью повышенной температуры (100120 С) придает способность адсорбироватьантитела к иммуноглобулинам,5 Учитывая широкую доступность методастерилизации (автоклавированием) и и ротивоаллергическое действие за счет трехкратного повышения устойчивости животных кгистамину позволяет использовать получен 10 ный иммуногемосорбент для проведенияклинических испытаний,Кроме того, заявляемый способ является экологически чистым, так как позволяетнаносить иммунолиганд на матрицу беэ15 применения каких-либо химических реагентов, а при использовании термическогоспособа иммобилизации исключает применение и токсических реагентов, например,глутарового альдегида.20 Формула изобретения Способ получения иммуногемосорбента, включающий инкубацию гемосорбента с последующей его отмывкой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышенияудельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов, сыворотку перед инкубацией дополнительно обрабатывают в катодной камере при силе тока 50 - б 0 мА в 30 течение 30 - 40 мин. а инкубацию проводят впроточном режиме.1797896 Таблица 2 Свойства полученных иммуносорбентов Содержание иммуноглобулинов в послесорбционном растворе,мг/мл Спектр наносимых нэ матрицу иммуноглобу- линов Сорбционный аффект,%Удельная сорбционнэя емкость мг/см сорбента- матрицы Пример 1 дМ цА 196 19 А 1 цМ 19 2,7 Исход. раст,93 60 0,016 0,19 80 0,016 67 93 0,20 0,016 94 80 0,15 93 70 67 0,0160,0067 0.18 0 0,90 0,20 1,30 Прототип Контроль 1 0,016 70 0,50 0,15 0,37 0,05 25 44 0,80 Контроль 20,18 75. 0,016 0,0067 59 93 0,20 0,90 Конт оль 3 50 1,35 Таблица 3 Испытание адсорбционной способности иммуногемосорбента и матрицы относительно антииммуноглобулиновых антител моноспецифических сыворотокТаблица 4 Выживаемость кроликов после проведения маятниковой гемосорбции на опытном и контрольном гемосорбентах, ул.Гагарина,728 Тираж Подписное ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5