Способ количественного определения фибриногена в плазме крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 0 О 1)А 6 ВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ГОС ПОД ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ У СВИДЕТ К АВТОРС(54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНАКРОВИ, включающий свертьногена плазмы коагулирс последующим количестведелением скоагулированногена, о т л и ч а ю щ ичто, с целью повышения тспособа, определяют кактак и несвертываемый троногены, а в качестве коаагента используют яд мноэфы (Еста шц 1 Свяцашайц У 11и Л.П.Цывкинаударственныйут им,Ленинского очности ег а 1.,-"АгсЬ. р. 2"Лабораторное 3-6 (прототип) свертыв мбином гулирую гочешуй а).(71) Алтайский госмедицинский инститкомсомола(56) 1. Рагйепг 1 ечВ 1 осЬеш", 1953, 462. Андреенко Г.дело", 1962, В 5,ВЕННОГО В ПЛАЗМЕ вание фибри- ующиМ агентоминым опрего фибриной с я тем,при 37 С. Затем сгусток, образовав 1шийся в пробирке, извлекают, промыва-ют в холодном растворе ИаС 1, сушат, отжимая на фильтровальной бумйге, и переносят в пробирку с 0,2 мл 0,.1 М раствора МаОН. Пробирку помещают на 10 мин в кипящую водяную баню до растворения сгустка, затем в,пробирку вводят 6 мл 12,5 й-ного раствора ИаДО и 1 мл. 0,1 М раствора СцБО, перемешивают 10 мин, добавляют 1 мл раствора фолина-Чикалто, разбавленного 1:2 дистиллированной водой и через 30 мин определяют оптическую плотность раствора на фотоэлектрокалориметре с красным фильтром. По привой разведений очищенного фибриногена показатели оптической плотности переводят в количество фибриногена, г/л.Яд змеи эфы многочешуйчатой (Есйдз шц 1 йздцашаСцз), обладая гемокоагулирующим действием, отличается от тромбина следующими свойствами: его действие не блокируется гепарином и комплексом антитромбин Ш-гепарин, он коагулирует так называемый "заблокированный" или тромбинорезистетный фибриноген, т.е. фибриноген, входящий в фибрин-мономерные комплексы.П р и м е р 2, Сравнительное определение концентрации фибриногена тромбином и ядом многочешуйчатой эфы при блокировании коагуляции гепарином,56 С ъ течение 5 мин); раствортромбина активностью в 20-5 с; рабочий раствор яда; разведения гепарина0,1-1,0 ед/мл, 1146002 .2Изобретение относится к медицине,в ча"тности к лабораторной диагности-ке нарушений свертываемости крови,Известен способ определения концентрации фибрииогена в плазме кровипутем высаливания сульфатом аммонияс последующим измерением коагулятафотокалориметрическим или спектрофотометрическим методом 1 .Однако данный способ не обеспечи Овает селективного определения фибриногена из-за частичного осаждениядругих белков плазмы.Наиболее близким к изобретениюпо техничесаой сущности и достигаемому результату является способколичественного определения содержания фибриногена в плазме,.включающийсвертывание фибриногена естественным ферментом тромбином, который 20обладает специфическим воздействиемтолько на фибриноген и не коагулирует другие белки, с последующимфотокалориметрическим определениемскоагулированного белка после его 25гидролиза 2 .Недостатками известного способа,являются невозможность определения.той части фибриногена, которая утра-тила способность свертываться тромбином, а также трудность сбора безпотерь .слабоконсолидированныхсгустков образующихся при синдромедиссеминированного внутрисосудистогосвертывания крови и других видах35Исследования на смешанной нормальпатологии. ной плазме (источник фибриногена) .Цель изобретения " повьппение точ- Реактивы: смешанная нормальнаяности способа, плазма с 3,5 г/л фибриногена; источПоставленная цель достигается тем, ник антитромбина Ш-дефибринированнаячто согласно способу количественного плазма (плазма, проинкубированная прнопределения фибриногена в плазме крови, включающему свертывание фибриногена плазмы коагулирующим агентом споследующим количественным определением скоагулированного фибриногена, 4определяют как свертываемый, так и . Проводится параллельное определен 45несвертываемый тромбином фибриногены, ние концентрации фибриногена известа в качестве коагулирующего агента ным и предлагаемым способами прииспользуют яд многочешуйчатой эфы различных уровнях гепаринизации испы(ЕсМз шц 1 зрашацз), туемых образцов плазмы.Результаты проведенных исследоваП р и м е р 1. К 0,2 мл цитратной ннй представлены в табл, 1.плазмы добавляют 4,8 мл мединалового Из табл. 1 видно, что нй фоне гебуфера (рН 7,4), инкубируют смесь паринизации количество фибриногенаоУпри 37 С в течение 5 мин, затем добав- свертываемого тромбином, прогрессивляют 0,1 мл рабочего раствора много но снижается начиная с концентрации39чешуйчатой зфы (1 10 -5 10 мг/мл), гепарина 0,3-0,4 ед/мл, а приперемешивают содержимое пробирки стек,6 ед/мл не определяется в связи сляной палочкой и инкубируют 10 мин полным блокированием свертывания. ВИз табл. 3 видно, что у здоровыхлюдей определяется примерно одинакоотличие от этого у больных с помощьюяда эфы выявилось достовернс большее тывании тромбином. После коагуляции тромбином и удаления образовавшихся сгустков при дополнительном введении яда ЕсЬдв шц 1 вяцаша 1 цв образовался второй сгусток из тромбинрезистентного фибриногена. В разных случаях количество такого заблокированного фибриногена составило в среднем 1,27-0,78 г/л, т,е. достигало значительных величинПри исследовании больных в Фазе полной несвертываемкости тромбином вызвать коагуляцию плазмы не удавалось, а яд эфы вызывал формирование плотного консолидированного фибринового сгустка. Проведение этанолового теста после свертывания тромбином выявляло фибрин-мономерные комплексы у больных с ДВС-синдромом в 80% случаев. В отличие от этого, после свертывания ядом эфы этаноловый тест всегда отрицательный, что говорит об осаждении заблокированного Фибриногена и фибрин-мономерных комплексов. этим коагулирующим агентом,П р и м е р . 4. Практическое использование предлагаемого способа определения содержания фибриногена в плазме крови на больных.Больная К.Н 25 лет. Диагноз: беременность 29 недель, внутриутробная гибель плода, ДВС-синдром, маточ. ное кровотечение несвертывающейся кровью.Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин 35 с;каолин-кефалиновое время свертывания 87 с (контроль 45 с); протромбиновое время 42 с (контроль 17); тромбиновое время 73 с (контроль 20 с); этаноловый тест - положительный.Содержание Фибриногена при коагуляции тромбином составило 0,70 г/л.Сделано заключение о выраженной гипофибриногенемии, Определение ядом эфы выявило 2,5 г/л фибриногена. Таким образом, с помощью яда выяви 30 3 1146002 4отличие от этого, при использовании Результаты проведенных исследовав качестве коагулирущего агента яда ний представлены в табл. 3.ЕсИв шц 1 йдвацашаСцв 7 гепаринизацияне влияет на количественное определение фибриногена в тех дозах, кото вое количество фибриногена при сверР ые полностью блокируют естественную тывании тромбином (известный метод)и ядом эфы (предлагаемый метод). ВТаким образом, предлагаемый методпозволяет определять концентрациюфибриногена в плазме даже при очень 10 количество фибриногена, чем при сверинтенсивной гепаринизации больньм,дающей полную несвертываемость крови.Исследования на растворе очищен%ного фибриногена.Реактивы: раствор очищенного 15фибриногена, содержащий 94% свертываемого белка (по Лоури) в концентрации 4,0 г/л; источник антитромбина Ш-дефибринированная плазма; раствор тромбина, активностью 20-5 с;рабочий раствор яда эфы; разведениягепарина 0,1-1,0 ед/мл,Параллельное определение концентрации фибриногена производится известным и предлагаемый способами приразных уровнях гепаринизации (табл. 2)Из табл, 2 видно, что при коагу-ляции тромбином гепарин вызываетуменьшение количества определяемогофибриногена, тогда как с помощьюяда выявляется весь введенный всистему фибриноген (4,0 г/л).1П р и м е р 3. Сравнительноеопределение содержания фибриногенапри свертывании тромбином (известным 35,способом) и ядом змеи ЕсЬдв шц 1 йввцашайцв (предлагаемым способом) убольных с синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертываниякрови (ДВС-синдромом). 40У этих больных выявилось болееили менее выраженное блокированиеФибриногена в фибрин-мономерныхкомплексах, что устанавливалосьопределением продуктов деградации 45фибриногена в плазме, а таже поположительным результатам этаноловогои протамин-сульфатного тестов. Контрольные исследования проводились наплазме здоровых людей. В двух опытных 50группах было 35 больных, в контрольной группе - 20 здоровых людей. Первую опытную группу составили больныес ДВС-,синдромами в фазе гипокоагуляции (20 человек), во вторую опытную 55группу (15 человек) вошли больныес ДВС-синдромами фс полной несвертываемостью крови.1146002 20. Количество фибриногена, г/л, при концентрации, ед/мл Фибриноген 0,1 0,20,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 .0,9 1 Скоагулиро.ванный тром- бином 3,5 3,5 3,0 2,2 1,3 Нет свертывания Скоагулированный ядоммногочешуйчатой эфы 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Флось значительное количество Фибриногена, не свертывающегося тромбином, в связи с чем сделано заключение об отсутствии истинной гипофибриногенемии,и наличии в плазме большого количества заблокированного Фибриногена количество которого составило по подсчету 2,5 г/л - 0,7 г/л = 1,8 г/л, Этаноловый тест после коагуляции тромбином оставался положи тельным, а после коагуляции ядом эфы становился отрицательным. Это позволило назначить адекватное лечение.Больной К.С., 23 г. Диагноз: состояние после операции по поводу 15 аневризмы ветви легочной артерии, ДВС-синдром, массивное кровотечение из послеоперационного шва, синяки на теле.Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин - 17 с; каолин-кефалиновое время свертывания 50 с (контроль 45 с); протромбиновое время 25 с (контроль 18 с); 25 тромбиновое время 23 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; при свертывании тромбином сформировался некачественный мелкозернистый сгусток, отжать и высушить ЗО который не удалось, ядом эфы определено 3,5 г/л фибриногена, Сделан вывод о массивном внутрисосудистом свертывании крови с образованием Фибрин-мономерных комплексов и бло 35 кированием в них Фибриногена бБольной Р.А., 45 лет, Диагноз:острый недифференцированный лейкоз,ДВС-синдром, кровоизлияние в мозг сгемипарезом, желудочное кровотечение.Синяки на теле, макрогематурия. Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин - нет свертывания; каолин-кефалиновое время свертывания - нет свертывания (контроль 50 с); проторомбиновое время 75 с (контроль 18 с); тромбиновое время 110 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; фибриноген при свертывании тромбином . составил 0,5 г/л, при коагуляции ядом эфы 4,5 г/л. Количество заблокированного Фибриногена составило 4,5-0,5 = 4,0 г/л, Назначенное лечение, соответствующее фазе ДВС-синдрома. Предложенный способ обеспечивает повышение точности определения концентрации Фибриногена в плазме за счет коагуляции как всертываемого, так и несвертываемого тромбином (тромбино-резистентного) фибриногенов, что имеет важное значение в диагностике массивного тромбоза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, дифференциации этих состояний с гипергепаринемией, что весьма важно для диагностики и лечения. Т а б л иа 1е1146002 Количество фибриногеиа, г/л, при концентрации, ед 1 мл1 Г Фибрнноген 0,1 6,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,1 0,8 0,9 1,0 4,0 4,0 4,0 3,0 2,5 1,0 0,1 Нет свертывания 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Таблица 3 Количество фибриногена, г/л Коагулирующийагент Больные, группа 2 0 2,7 2,0-4,0 Тромбин Яд многочешуйчатойэфы 2,0-4,5 1,5 3,6 0,05 1,5 0,90 Разница Свертывание ядом . эфы после тромбина (дополнительное количество фибриногена) 0,86 0 Свертывание тромбиномпосле яда эфы 0 0 0 Свертывание этаноломпосле тромбина(Х положительныхреакций) 0 85 Свертывание этаноломпосле я а э ы 0 0 0 Редактор А. Козориз Корректор И. Розман Заказ 1244/3 Тираж 722 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Скоагулированныйтромбином Скоагулированный ядоммногочешуйчатой эфы Контроль, Больные, здоровые лкди группа 1 1 Составитель Е. Пазин Техред Л.Иартяшова