Способ обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез

(51)5 А 61 В ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 ЕЛЬСТВУ 31ь АВТОРС В 2н(54) СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НАТУБЕРКУЛЕЗ Изобретение относится к ветеринарной . микробиологии и может быть использовано в диагностике туберкулеза.Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ подготовки биологического материала для бактериологических исследований на туберкулез, включающий измельчение тканей, обработку серной кислотой и тщательное растирание пестиком в ступке.Недостатком указанного способа является то, что при исследовании лимфатических узлов беэ туберкулезных поражений используется лишь часть измельченного материала, что значительно снижает его диагностическую ценность, так как внутри обрабатываемых кусочков и в неиспользованных частях тканей, доставленных для исследований, может содержаться возбудитель болезни, который не попадает в исследуемый материал.Цель изобретения - повышение точности способа бактериологической диагностики туберкулеза. ом, ить ОПИСАНИЕ Ж 1734699 А 1(57) Использование: ветеринарная микробиология, диагностика туберкулеза, бактериология обогащения биологического материала, Сущность изобретения; в способе обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез предварительно измельченный материал обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4 медицинского пепсина и 10-ный раствор соляной кислоты, Обработку проводят в течение 3 ч при постояннЬм перемешивании, 4 табл. Существенное отличие способа в тчто он позволяет максимально высвободвозбудителя из биологического материала,т,е, то его минимальное количество, котороеобеспечивает рост микобактериальных колоний на питательных средах и развитиетуберкулезного процесса у лабораторныхживотных,Способ осуществляется следующим образом.Отобранные лимфатические узлы дляисследований тщательно измельчают ножницами и переносят в коническую колбу(250-500 мл), в которую заливают на однучасть измельченной лимфатической тканишесть частей искусственного желудочногосока с 4-ной концентрацией медицинского пепсинаи 1-ной соляной кислоты (РН1,6-2), нагретого до 35-37 С, Затем в колбуопускают магнитную палочку, Колбу закрывают капроновой пробкой, стявят на магнитную мешалку (ММ) и помещают втермостат, Ферментацию проводят притемпературе 35-37 С в течение трех часовпри непрерывной работе мешалки (1 тыс, об/мин).По окончании ферментации содержимое колбы отстаивают в течение 30-40 с и надосадочную жидкость сливают в центрифужные флаконы, которые, в случае открытого центрифужного диска. закрывают пробками, помещают в предварительно дезинфицированную центрифугу и центрифугируют в течение 5 мин, при 4 тцс, об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок серо-белого или белого цвета, в зависимости от вида лимфатических узлов животных, объединяют, заливают 6-10-ным раствором серной кислоты (1:7), тщательно перемешивают стерильной стекляной палочкой и центрифугируют 5 мин при 4 тыс, об/мин,Надосадочную жидкость сливают, а осадок, представляющий собой сметанообразную массу и составляющий обычно 8 - 9 частей от количества исходного материала (лимфатической ткани), дважды отмывают физиологическим раствором (1:7) тщательным перемешиванием стерильной стеклянной палочкой, соблюдая стерильность с последующим центрифугированием в течение 5 мин, при 4 тыс, об/мин. Затем, после повторного отмывания, надосадочную жидкость сливают с последующим прибавлением к осадку такого количества физиологического раствора, которое обеспечивает набор в шприц тщательно перемешанного осадка, т.е. используемый для дальнейших исследований материал должен представлять собой консистенцию, превышающую по густоте консистенцию молочных сливок, Посев на питательные среды проводят платиновой петлей.П р и м е р 1. Для исследования влияния способа ферментации на высеваемость микобактерий туберкулеза из биологического материала (лимфатических узлов) от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с различной зпизоотической ситуацией в отношении туберкулеза и результаты биологической пробы, в сравнении с известным (способ А.П.Аликаевой), исследовали одновременно 40 проб.Результаты исследований материала по предлагаемому способу и известному представлены в табл. 1,В результате проведенных исследований установлено, что при обработке способом фермента ции биоматериала с патологическими изменениями, отобранного на секции от трех животных неблагополучных стад, во всех случаях получены культуры микобактерий туберкулеза и одновременно, положительные результаты био логической пробы, При обработке способом А,П.Аликаевой соответствующие данные по культуральным и биологическим исследованиям установлены в двух иэ трех проб. При исследовании материала без макроскопических поражений от 26 животных, реагирующих на туберкулин, неблагополучных хозяйств положительный результат при культуральных исследованиях получен впяти (19,2 пробах и при биологических - в 5 10 16 (61,5) пробах, обработанных способом ферментации, а по способу А.П.Аликаевой аналогичные результаты получены, соответственно, в трех (11,5) и в пяти (19,2) пробах. При одновременном исследовании обоими способами частей лимфатических узлов, отобранных от реагирующих на туберкулин животных хозяйств, находящихся в режиме благополучия, получен отрицательный результат.В табл, 2 представленц сравнительные данные сроков появления роста культур ми 15 20 кобактерий туберкулеза на питательныхсредах.Из нее следует, что при исследованиибиоматериала с туберкулезными поражениями двумя способами начало роста культур отмечается одновременно на 30-й день. При исследовании биоматериала без туберку 30 лезных поражений также не отмечено достоверных различий в сроках появления роста культур микобактерий туберкулеза. Эти данные также подтверждают отсутствие влияния искусственного желудОчного сока на биологические свойства микобактерий туберкулеза,Анализ данных исследований каждой пробы в отдельности, полученных по способу А,П,Аликаевой, не выявляет достоверных различий между культуральными и биологическими результатами. Так, в семи пробах, в которых получен положительный резуль 35 40 тат на туберкулез по биологическим исслеже время при исследовании по способу ферментации такой рост отсутствует в 11 пробах, что в 5,5 раз больше, чем по рутинному способу. Эти данные свидетельствуют о том, что повышение результативности разработанного способа отмечается в основном за счет проведенйя биологических исследований,В табл, 3 представлены обобщенные результаты биологических исследований указанных выше проб.Из нее следует, что если при заражении морских свинок материалом, приготовленным традиционным способом А.П,Аликаевой, в течение трех месяцев наблюденияг дованиям, рост культур на. питательных45 средах отсутствует лишь в двух пробах. В топало, начиная с 50 дня после заражения, семь (8,7) опытных животных с признаками туберкулеза, то при заражении морских свинок материалом, приготовленным разработанным способом, пало, начиная с 30 5 дня,15 (18,7 Ц, что в два раза больше, чем в первом случае, Особенно показательны эти данные по результатам исследований биоматериала без изменений, полученные от крупного рогатого скота неблагополуч ных хозяйств, В этих пробах число заболевших животных, зараженных материалом по испытываемому способу, увеличивается до 2,2 раэ, а из числа свинок подвергнутых ветеринарно-санитарной экспертизе, по за вершении эксперимента - до 5,6 раз.Во всех случаях наблюдается совпадение результатов бактериологических исследований, полученных по способу А.П.Аликаевой, с результатами, полученны ми при исследовании по способу ферментации.П р и м е р 2. Для изучения возможного влияния желудочного сока на вирулентные свойства возбудителя проведено исследо вание шести культур микобактерий туберкулеза, полученный от трех проб материала, обработанных по способу А,П.Аликаевой и ферментации одновременно, Для этого проведено заражение морских свинок 0,1 мг 30 суспензии микобактерий туберкулеза каждой иэ полученных культур по указанным способам, Результаты показывают, что все животные, зараженные культурами, выделенными способом ферментации и А.П.Али каевой, погибают в течение трех месяцев,При этом, из числа животных, зараженных культурами, выделенными по способу А.П.Аликаевой, морские свинки погибают в течение 56,8 + 5,7 дней, а по способу фер ментации - 60,0 . 9,4 дней (Р 0,05), Это свидетельствует об отсутствии какого-либо влияния искусственного желудочного сока на вирулентные свойства изучаемых культур микобактерий туберкулеза. На зто ука зывают и результаты исследований, приведенные в таблице 3.Результаты исследований свидетельствуют о том, что лизис биоматериала, представленного для исследований. 50 способствует высвобождению микобактерий из тканей лимфатических узлов, обогащению ими осадка при центрифугировании.В связи с тем, что для получения положительного результата биологической пробы 55 на морских свинках достаточно пяти мико- бактерий туберкулеза, а для роста культур на питательных средах 20 - 100, объясняется повышение достоверности ферментативного способа и, следовательно, то, что побиопробе туберкулеза устанавливается вболее частых случаях, чем при культуральных исследованиях этим же способом. Более достоверное различие в совпадениибиопробы с культуральными исследованиями при использовании способа ферментации, в сравнении с контрольным способом,свидетельствует именно о высвобождении иналичии того минимального количества возбудителя в 1 мл исследуемого материала,которое вызывает туберкулезный процесс уморских свинок, в то время как культуральные исследования дают отрицательные результаты, Этого не наблюдается приисследовании традиционным способом, гдевысвобождается, вероятнее всего, такоечисло микобактерий, введенных морскимсвинкам, которое в большинстве случаевобеспечивает и появление роста культур микобактерий туберкулеза на питательныхсредах.В табл, 4 приведены обобщенные данные сравнительной эффективности культуральных и биологических исследованийкаждой пробы двумя способами,Иэ нее следует, что по разработанномуспособу положительные результаты .бактериологических исследований на туберкулезполучены в 47,50 , апо традиционному, широко применяемому вветеринарной практике способу - в 17,5 пробах биологическогоматериала, что в 2,7 раза меньше, чем попредложенному,Применение в разработанной методикеискусственного желудочного сока, магнитной мешалки существенно облегчает технический труд специалистов, позволяет вдотоверно большем объеме использоватьматериал, поступающий для исследований,Таким образом, использование предлагаемого способа. позволяет повыситьэффективность результатов бактериологических исследований биологическогоматериала (лимфатических узлов) в 2,7 раза, что, в свою очередь, дает возможностьповысить точность диагностики туберкулеза. Это достоверно повысит эффективностьдиагностики болезни и во многих случаяхпредупредит широкое распространение туберкулеза животных.Формул а изобретен ияСпособ обогащения биологического материала при бактериологическом исследовании на туберкулез, включающий взятиелимфотической ткани с последующим иэмельчением, обработкой раствором сернойкислоты и гомогенизацией, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышениячастоты высеваемости микобактерий, из1734699 Таблица 1 Примечание: ф - исследовано по способу ферментации; А - исследовано по спосо Аликаевой (прототип). таблица имечание. ф- исследовано по способу ФВРментации А- исследовано по способу Аликаевой. мельченный биологический материал дополнительно обрабатывают искусственным желудочным соком, содержащим 4 оь-ный медицинский пепсин и 1-ный раствор соляной кислоты, причем обработку. проводят3 ч при постоянном перемешивании.10 1734699 Та.бпица 3 Сравнительные результаты сроков гибели и ветеринарно-санитарной экспертизы павших и убитых морских свинок Исследуемыйматериал Пало в течение 3 нес. с туберкулезными поражениями Исследовано проб Убито по 3 мистечении ес,в том числе иафдемь 7 г 80 81-90 30-40 41-50 51-60 установлены изменения всего Ф А Ф АФ Ф 116 1 2 - 43 51 19 5 2 9 5 7 том числе: с изменен 4 2 2 12 3 измемеий 2 4 47 17 3 11 51 О Из благ.хозяйств1 ИТОГО 4 2 22 9 4 - 1 6 3 19 5 вано по слособу Ферментации; А " исследовано по способу Аликаево м е ч а и и е. Ф Таблица 4 ч а н и е: Ф - исследовано по способу способу Аликаевой.П нтации: А- исследовано Составитель В. Матузенкоедактор И. Ванюшкина Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцов каз 1760 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при.ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 . Из неблалучныхвсего гопоунктов,2 Число зараменкых морских свинок всего Ф А 1