Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита

СО 03 СО 881 СКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРГСПУБЛИК ц 5 6 01 М 33/74 ОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИРИ ГКНТ СССР НИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ О ТЕЛЬС К АВТОРСКОМУ С.КондакоН.В. Автореферат канд. . 13.АГНОСТИКИ ЮВЕНИЛЬИДНОГО АРТРИТА Изобретение относится к медицине, аименно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ювенильного ревматоидного артрита.Целью изобретения является повышение точности диагностики и упрощение способа.СпоСоб осуществляют следующим образом.Для оценки влияния преднизолона на спонтанную активность клеток периферической крови используют метод культивирования цельной крови в микроплатах. Для исследования используют культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10, сыворотки крупного рогато го скота и антибиотиков ( пенициллина истрептомицина по 100 ЕД/мл). На 100 мл этого раствора добавляют 3-ный глютамин (1 мл); 7,5-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10-ный хлористый кальций (0,07 мл) и 40-ную глюкозу (0,25 мл), Гепарини(21) 4752986/14 (22) 23.10.89(46) 07.04.92. Бюл (71) Ленинградск цинский инсти вательский инс медицины АМН (72) В.В.Юрьев, ва и В.И.Пуринь (53) 616.07 (088.8 (56) Слизовский дисс. - Л 1988, с (54) СПОСОБ ДИ НОГО РЕВМАТО(57) Изобретение относится к медицине, а именно ревматологии, и может быть использовано для диагностики ювенильного ревматоидного артрита. С целью повышения точности диагностики и упрощения способа, основанного на исследовании спонтанной активности лимфоцитов периферической крови ин витра, определяют спонтанную активность лимфоцитов в присутствии преднизолона в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, и при увеличении активности по еравнению с исходной диагностируют ювенильный ревматоидный артрит. 3 табл. эирован ную венозную кровь(25 - 30 ед. гепарина на 1 мл крови) смешивают с 10-ным желатином в отношении 5:1 и инкубируют при 37 С в течение 30 мин. Лейковзвесь снимают, производят подсчет общего числа лейкоцитов и разводят культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс./мл, 0,15 мл этой суспензии вносят в каждую лунку полистиролового 96-луночного у-образного планшетадля иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн. аутологических эритроцитов на лунку. Для каждого больного ставят по 6 культур, В половину культур вносят преднизолон в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, другие три культуры служат контролем без преднизолона. Затем культуры имкубируют при 37 С в атмосфере абсолютной влажности с 5СО 2(в С 02- инкубаторе "Бои", Великобритания) в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносят радиоактивную метку (0,4 мкКи Н-тимидина на лунку), По 1725 3250 сле окончания инкубации культуры снимают с помощью коллектора с осаждением и промывкой клеток на фильтрах, Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивают, помещают в счетные флаконы со сцинтиллятором и просчитывают на сцинтилляционном счетчике "Ракбета" (КВ, Швеция), Сцинтиллятор готовят следующим образом: на 1 л толуола берут 5 г2,5-дифенилоксазола (ППО) и 100 мг 1,4-ди 2-(5-фенилоксазолил)-бензола (ПОПОП). ПОПОП предварительно смешивают с 100200 мл толуола и в течение 20-30 мин греют на водяной бане под ватно-марлевой пробкой до полного растворения, Компоненты смешивают и сцинтиллятор выдерживают в темноте в течение 1-2 сут, после чего используют, внося по 5 мл на счетный флакон, Оценку функциональной активности лимфоцитов проводят по спонтанному синтезу ДНК лимфоцитами периферической крови; что учитывают по включению радиоактивной метки Н-тимидина в ДНК лимфоцитов и выражают числом импульсов в минуту.После получения результатов со счетчика вычисляют среднее значение показателя включения метки для культур без препарата (с ошибкой средней) и границы доверительного интервала для этих показателей спонтанной функциональной активности лимфоцитов периферической крови каждого больного с вероятностью Р = 0,95 по методу определения доверительной зоны линейной регрессии. Вычисляют такжесредний показатель включения метки в ДНК в присутствии предниэолона также для каждого больного. Этот показатель сравнивают с границами доверительного интервала показателей спонтанной активности лимфоцитов. без преднизолона для анализируемого больного. Если показатели спонтанной активности лимфоцитов в присутствии преднизолона выше верхней границы или ниже нижней границывычисленного доверитЕльного интервала, то говорят о достоверном изменечии функциональной активности лимфоцитов под влиянием преднизолона. Если показатель спонтанной активности лимфоцитов в присутствии предниэолона находится в пределах доверительного интервала, то преднизолон не оказывает достоверного влияния на спонтанную активность лимфоцитов. В этом случае говорят об отсутствиивлияния преднизолона на спонтанный синтез ДНК или об отсутствии чувствительности клеток периферической крови к преднизолону.П ри м е р 1, Больная Коржаева Е.,1983 г, рождения, поступила в кардиоревматоло 1015202530354045 гическое отделение 02.12.87 г, Из анамнеза известно, что девочка заболела 1,5 года на-. зад, когда после травмы появилась. болезненность при ходьбе и отечность левого голеностопного сустава. Лечилась амбулаторно нестероидными противовоспалительными средствами. На протяжении заболевания отметили присоединение пястно-фалангового сустава 2-го пальца правой руки. При поступлении суставы дефигурированы, отмечалось ограничение подвижности. При отфальмологическом обследовании выявлен правосторонний увеит.Было проведено обследование по предлагаемому способу сразу при поступлении в стационар. Для исследования использовали культуральную среду, приготовленную из среды 199 с добавлением 10 О сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 100 ЕД/мл). На 100 мл этого раствора добавляли 3 о-ный глютамин (1 мл); 7,5;6-ный гидрокарбонат натрия (2,5 мл); 10 6-ный хлористый кальций (0,07 мл); 406-ную глюкозу (0,25 мл). Гепаринизированную(25 - ЗОЬд.гепарина на 1 мл крови) венозную кровьсмешивали с 10 О- ным желатином в отношении 5:1 и инкуби-ровали при 37 С в течение 30 мин. Лейковзвесь снимали, производили подсчет общего числа лейкоцитов и лимфоцитов и разводили культуральной средой до концентрации лимфоцитов 130 тыс/мл. 0,15 мл этой суспензии вносили в каждую лунку полистиролового 96-луночного ч-образного планшета для иммунологических реакций, добавляя дополнительно 10 млн аутологичных эритроцитов на,лунку. Для каждого больного ставили по 6 культур. В половину культур вносили преднизолон в концентрации 0,1 мкг/мл культуры, другие три культуры служили контролем без преднизолона. Затем культуры инкубировали при 37 С в атмосфере абсолютной влажности с 57 О С 02 в течение 72 ч. За сутки до окончания инкубации вносили радиоактивную метку (0,4 мкКи Н-тимидина на лунку), После окончания. инкубации культуры снимали с помощью коллектора с осаждением и промывкой культур клеток на фильтрах. Фильтры с исследуемым клеточным материалом высушивали, помещали в счетные флаконы.со сцинтиллятором и просчитывали на сцинтилляционном счетчике, Использовали сцинтиллятор следующего состава: на 1 л толуола 5 г ППО и 100 мг.ПОПОП. На счетный флакон вносили по 5 мл сцинтиллятора. Оценку функциональной активности лимфоцитов проводили по спонтанному синтезу ДНК лимфоцитами периферической крови, что учитывали по включению радиоактивнойметки в ДНК лимфоцитов и выражали чис- При получении результатов со счетчикалом импульсов в минуту. вычисляли средний показатель включенияПослеполученияреэультатовсосчетчи- радиоактивной метки в ДНК лимфоцитовкэ вычисляли среднее значение показателя контрольной группы детей (10 человек), ковключения метки для культур без препарата 5 торый составил 318 й 38 имп/мин. О значии границы доверительного интервала для тельном достоверном .повышенииэтих показателей с вероятностью Р=0,95 по спонтанного синтеза ДНК у больного говометоду определения доверительной зоны рили при средних показателях, превышаюлинейной регрессии. Вычисляли также щих М +1,56 группы здоровых детей (т.е.средний показатель включения метки в ДНК. 10 489 имп/мин). Получены результаты: среда присутствии преднизолона. Получили ре- ний показатель спонтанной активностизультаты: спонтанный синтез ДНК лимфа- лимфоцитов больной составил 407цитами в культурах без преднизолона 577 имп/мин, что не выше вычисленного предеимп/мин. при доверительном интервале ла М ф. 1,56 (489 имп/мин) здоровых детей.514-640 имп/мин. Спонтанный синтез ДНК 15 Полученные данные отрицают диагнозв культурах с преднизоланом 245 имп/мин. ЮРА,По данным обследования выявлено досто- Контрольное комплексное обследоваверное изменение (ингибиция) спонтанной ние, проведенное еучетом клинико-лабораактивности лимфоцитов под влиянием торных, .рентгенологических данных напреднизолона, на основании чего выстав основе критериев диагностики ЮРА,позволендиагноз; ювенильный ревматоидныйар- лило поставить диагноз ЮРА.трит (ЮРА). Такимобразом, выявленосовпадениедиПроведено обследование по известно- агноза,.поставленного предлагаемым спосому способу. В гепаринизированной крови бом, и несовпадениедиагноза по известномупроизводили подсчет общего числа лейко способу с контрольным диагнозом.цитов и лимфоцитов. В культуру(общий обь- П р и м е р 2. Больная Диденко И., 1974ем 3 мл) вносили 5 х 1.0 лимфоцитов, что г. рождения. Поступилэ:в кардиоревматолосоставило 0,2 мл цельной крови. Культу- гическое отделение 23;10,87 г с жалобамирал.ьная среда состояла иэ среды 199 с 10 на болезненность при движении в лучезапясыворотки крупного рогатого скота и анти стных суставах обеих рук. Из анамнеза избиотиков(пенициллина и стрептомицина по вестно, что девочка заболела 10 дней назад,100 ЕД/мл культуральной среды). Смесь ин- когда через 20 дней после ожога появиласькубировали при 37 С в течение 24 ч, За 5 ч отечность и болезненность правого лучезадо окончания опыта в культуры вносили по пястного сустава, затем присоединился вто 2 мкКи Н-тимидина в обьеме 0,1 мл. На 35 ройлучезапястныйсустав. При поступленииследующий день во флаконы добавляли 3- внешне суставы не изменены, местно - поную уксусную кислоту(УК) для лизиса эрйт- " вышение температуры. Лабораторная акроцитов, содержимое флаконов переносили тивность невысокая (СОЗ 15 мм/ч, СРБ 1+),в центрифужные пробирки, флаконы про- рентгенологически изменений со стороны сумывали 3%-ной УК и смыв добавляли в цен ставов не выявлено. За время нахождения втрифужные пробирки. Осажденные клетки стационаре(1,5 месяца) получала лечение нересуспендировали снова в Зо -ной УК и цен- стероидными противовоспалительными претрифугировали. После второго центрифуги- паратами, проведен курс антибактериальнойрования к осадку добавляли 5 мл холодной терапии с положительным эффектом.Бо -ной трихлоруксусной кислоты (ГХУ), и 45 Было проведено обследование по предпробирки выдерживали при 4 С в течение лагаемому способу Согласно.примеру 1,30 мин до полного выделения из клеток кис- Получены результаты;. спонтанная активлоторастворимыхфракций.Послеэтогаоса- . ность лимфоцитов больной 242 имп/миндок дважды отмывали 57 ь-ной ТХУ. при доверительном интервале от 193-291Кислотонераствримые фракции осаждали 50 имп/мин с точностью Р =.0,95. Показательна нитроцеллюлозных мембранных фильт- спонтанной активности лимфоцитов в прирах. Высушенные фильтры с фиксирован- . сутствии преднизолона 204 имп/мин, т,е. неным на них материалом помещали на дно.выходит за пределы вычисленного доверифлаконов для сцинтилляционного счетчика тельного интервала, Полученные результаи заливали 5 мл сцинтилляционной жидко ты отрицают диагноз ЮРА.сти следующего состава; 4 г ППО и 0,05 г Проведено обследование согласно иэПОПОП на 1 лтолуола. Пробы просчитывали вестному способу аналогично примеру 1.на жидкостномсцинтилляционном счетчике Получены результаты: показатель спонтани результаты выражали числом импульсов ного синтеза за ДНК в лимфоцитах больнойза 1 мин.1725132 Таблица 1 495 имп/мин, т.е. по сравнению с вычисленным пределом М й 1,56 здоровых детей(489 . имп/мин) показатель повышен,.что предполагает диагноз ЮРА.Комплексное контрольное обследова ние при выписке позволило поставить девочке диагноз: реактивный артрит (послеожоговый). т,е; диагноз ЮРА был отвергнут.Таким образом, данный пример демон стрирует повышение точности диагностики предлагаемым способом по сравнению с известным, так как отмечалось совпадение диагноза по предлагаемому способу с контролем. Диагноз, поставленный соглас но известному.способу, не совпал с контрольным.П р и м е р 3. Больной Уразгалиев А., ,1975 г. рождения, поступил 08.01.88 г. Заболел 2,5 месяца назад, когда через 2 недели 20 после перенесенной ОРВИ появилась отечность и болезненность правого коленного сустава. Сустав дефигурирован, болезненный при пальпации, утренняя скованность длится 15 мин. Лабораторная активность 25 высокая (СОЭ 42 мм/ч, СРБ 3+), выявлен РФ в сыворотке в титре 1:128 реакцией. ВаалерРозе. Рентгенологические изменения в сус-.таве соответствуют ст. по Штейнброкеру.При поступлении проведено обследова ние по предлагаемому способу аналогично примеру 1, Получены результаты: спонтан-ный синтез ДНК лимфоцитами 389 имп/мин при доверительном интервале от 345-433 имп/мин. Спонтанная активность лимфоци- . 35 тов больного в культуре с преднизолоном 488 имп/мин. Полученные данные демонстрируют наличие стимулирующего влияния преднизолона у данного больного, что предполагает диагноз ЮРА. 40 Проведено обследование согласно известному способу аналогично примеру 1, Получены результаты: спонтанный синтез ДНК 803 имп/мин, что превышает показатель М + 1,56 контрольной группы детей. равный 489 имп/мин. Полученные данные позволяют поставить.диагноз ОРА.Проведено комплексное обследование, на основании которого мальчику выставлен диагноз ЮРА контрольный диагноз).. Таким образом, отмечается совпадение диагноза, поставленного по предлагаемому и известному способам, с контрольным диагнозом;Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики на 41 за счет возможности выявления разбалансированности системы иммунорегуляции, характерной для ОРА, и упростить способ за счет исключения необходимости обследования контрольной группы здоровых детей.В табл; 1 дана оценка точности диагностики ЮРА при использовании предлагаемого способа; в табю. 2 - то же, при известном способе; в табл. 3 - сравнительная.оценка способов,Ф о р.м у л а и э о б р ет е н и я Способ диагностики ювенильного ревматоидного артрита путем исследования спонтанного синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови ин витро, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности диагностикИ, периферическую кровь обрабатывают пред.ниэолоном в концентрации 0,1 мкг/мл и при изменении спонтанного синтеза ДНК в пробе после обработки преднизолоном диагностируют ювенильный ревматоидный артритаз 1172 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж-ЗБ, Раушская наб., 4/б изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101