Способ получения цитохрома р-450

(5 ф)5 С 12 й 1/38," " " г",с 1,ч1 ЕТЕ ИС И ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(56) 1, Соколов Ю. И., Аветисова С. М., Давыдов Е. Р. Выделение, очистка и свойства цитохрома Риз дрожжей рода Сапбба, выращенных нэ н-лаканах. - Биохимия, 1986, т, 51, М 10, с. 1649-1654.2. Маг) , О Гцса А 3. Р)епрЬагЫса. ,пбцсбоп оУ э зоЬЫе Сутос)гоп)е р-серепбеп Ратху Асб Мопоохуцепазе и Васцз п)ецасегип), - .оогпа оГ Вооцса Сцензажгу, 1982, ч. 257, р. 2147-2152. Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов.Известен способ получения дрожжевого цитохрома Р(11.Недостатком способа является то, что свойства фермента, получаемого согласно этому способу, могут определяться липидным окружением.Наиболее близким в предлагаемому является способ получения растворимого цитохрома Риз Васцз п)ецайегва (2).Целью изобретения является ускорение способа эа счет сокращения времени индукции фермента.Способ заключается в том, что используется 18-часовая культура клеток Ас)оеразп)а абаа, штамм ИЭМ, а в качестве индуктора - толуол в концентрации 0,01 об,0 ь, Через 3 ч роста культуры в(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов. Целью изобретения является ускорение способа за счет сокращения времени индукции фермента. Способ заключается в том. что используется 18-часовая культура клеток Ас)оеразгпэ абаМ, штамм ИЭМ, а в качестве индуктора - толуол в концентрации 0,01 об.;ь. Через 3 ч роста культуры в присутствии толуола клетки используют для получения индуцированного цитохрома, Выход составляет 1,5 ммоль/мг белка или 40-45 ммоль/г сырых клеток. 2 табл. присутствии толуола клетки используют для получения и характеристики индуцированного цитохрома.Штамм ИЭМклеток Ас)оеразп)э абаа депонирован в лаборатории микро- плазм и :форм бактерий НИИЭМ им, Н, Ф, Гамалеи,П р и м е р. Культивирование клеток проводят на среде, 1 л которой содержит, г: триптоза 20; ацетат натрия 5; хлористый натрий 5; хлористый калий 1,3; трис 3,4; рН 8,0-8,2. Перед посевом клеток в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота до концентрации 5 об.Яглюкозу до 1 об,;ь и пенициллин 500 ед./мл. Культивирование клеток проводят при 37 С в течение 18 ч. После этого в культуру вносят толуол до конечной концентрации 0,01 об,0 и выращивают еще 3 ч при постоянном встряхивании в колбе с притертой крышкой. Затем клеткиосаждают центрифугированием на центрифуге при 10000 9 в течение 10 мин и дважды отмыва 1 от в том же режиме средой, содержащей 200 мМ хлористого натрия, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НС 1, рН 7,4. Осадок клеток суспендируют в 0,132 М К-фосфатном буфере или 100 мМ трис-Н С буфере, рН 7,4, и замораживают при - 20 С, Клетки и цитозольную фракцию используют для определвния активности полученного цитохрома в течение 3-5 дней.Получение цитозольной фракции проводят следующим образом.Клетки лизируют при комнатной температуре в бидистиллированной воде с добавлением амидопирина до конечной концентрации 2 мМ (защита цитохрома от инактивации) в течение 30 мин. Далее осаждают неразрушеные клетки при 12000 д в течение 20 мин, а полученный супернатант центрифугируют при 105000 9 в течение 1;5 ч для осаждения мембран. Полученный супернатант концентрируют при+4 С в течение 3-5 ч, используя фильтр. Цитоэольная фракция имеет конечную концентрацию белка 2-5 мгlмл, Концентрацию белка определяют микробиуретавым методом,Содержание цитохрома Рв полученном препарате определяют по методу Омура и Сато, используя коэффициент молярной экстинкции для Р, равный 91. мМ см, а для Р-111 мМ см Содержание цитохрома Рв контрольных (не индуцировэнных) клетках составляет 0,05-0,08 нмоль/мг белка, а в индуцированных - 1,2-1,5 нмоль/мг белка. Абсолютный спектр восстановленного дитионитом и окисленного цитохрома записывают в диапазоне длин волн от 650 до 400 нм на спектрофотометре М, Дифференциальный спектр цитохрома клеток Асйоеразгпа 1 а 1 б 1 ааП, штамм ИЭМпри индукции его толуолом совпадает со спектральными характеристиками фермента из Рзеобоаопаз рМба.Выход цитохрома Р40-45 нмоль/мл сырых клеток.Характеристические максимумы цитохрома Рпри его индукции толуолом в клетках АсЬоер 1 азгпа 1 а 1 б 1 авП, штамм ИЭМ: окисленный 580, 530, 418 нм; восстановленный 550, 408 нм, Для клеток Рз. ротба: окисленный 570, 535, 418 нм; восстановленный 540, 408 нм,Субстратную специфичность полученного фермента проверяют следующим образом. 1 мл инкубационной смеси при определении скорости деметилирования амидопирина содержит 100 мМ К-фосфатного.буфера, рН 7,6, 8 мМ амидопирина и 2-4об, близка к насыщающей.Данные, показывающие зависимостьсодержания цитохрома Рв клетках А.45 1 а 1 б 1 аи 1, штамм ИЭМпри использовании18-часовой культуры и толуола в концентрации 0,01 об.0 от времени индукции средние значения иэ 3 опытов) приведены в табл. 1.Данные, показывающие зависимость 50 содержания цитохрома Рв клетках А,1 а 1 б 1 аФ 1, штамм ИЭМот концентрации толуола и возраста культуры (средние значения из 3 опытов) приведены в табл. 2,Ф ар мула изобретения 55 Способ получения цитохрома Р,включающий введение химических соединений-индукторов в среду роста культуры микроорганизмов. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа за счет сокращения времени индукции фермента, в 152025303540 мг цитозольного белка. Реакцию запускаютдобавлением 6 мМ НАДФН.Смесь инкубируют при постоянном встряхивании при 27 С в течение 30 мин. После инкубэции реакцию останавливают добавлением 0,4 мл 15 ТХУ, Пробы центрифугируют при 5000 д в течение 15 мин, Для определения формальдегида отбирают1 мл надосадочной жидкости и приливают 2 мл реактива Наше (0,26 мл ацетилацетона, 0,29 мл ледяной уксусной кислоты и 15,4уксуснокислого аммония на 100 мл реактива), Пробы инкубируют 45 мин в водяной бане при 37 С и измеряют оптическую плотность при длине волны 412 нм.Скорость деметилирования кодеина и диметиланилина определяют также по концентрации образующегося в ходе реакции формальдегида, При этом инкубационнаясмесь содержит 6 мМ кодеина или 6 мМ диметиланилина. Для построения калибровочных кривых используют стандартный 400/,-н ый формал ьдегид.Гидроксилазная активность цитоэольной фракции составляет по амидопирину 1,6 нмоль/мл белка, по кодеину - 2,4 нмоль/мл белка, по диметиланилину - 3,5 нмоль/мгбелкаТаким образом, при индукции цитохрома Рв клетках Асйо 1 ер 1 азгпа 1 а 1 б 1 ааП, штамм ИЭМнаблюдается увеличение егосодержания в расчете на 1 мг белка приблизительно в 30 раз.При времени индукции, меньшем или большем чем 3 ч, внутриклеточное содержание фермента меньше максимального, Меньший эффект наблюдается и при использовании меньшей концентрации толуола или более молодой культуры. Большуюконцентрацию индуктора использовать нецелесообразно, так как концентрация 0,011693043 Таблица 1 Таблица 2 Составитель А.СеменовРедактор О,Юрковецкая Техред М,Моргентал Корректор Т.Малец аказ 4051 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушскэя наб 4/5 водственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 качестве микроорганизма используют культуру клетки АсЬоеразаа абав, штамм ИЭМ, а в качестве химического соединения-индуктора - толуол в концентрации 0.01об. , который вводят в среду роста 18-часовой культуры и доращивают ее 3 ч.