Способ культивирования ооцитов коров

(51)5 С 12 Ы 5/00 ГОСУДАРСТВЕН.ЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ВТОРСКО ВИДЕТРЛЬС 393657/138,03,880.06.91. Бюл. М 24енинградский готетП. Гончарова, А.А.В. Романюк, Т. ственный униев, Т.И. Кузьи Б.П. ЗаверН. Ваесй 1, М 3, р,р. 757 -К. Голу А. Гойл 8.085,23(088,8) О, (воэрооэгоучсе, гпооцу, 1979, ч, 104,Изобретение относится к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии.Целью изобретения является повышение выхода созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом.Способ состоит в следующем. Из яичников коров путем надреза фолликулоз (не менее 0,5 мм в диаметре) выделяют ооциты в комплексе с гранулезными клетками и помещают в культуральную среду ТСна растворе Хэнкса с гепарином 2 ед/мл и антибиотиками 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 мкг/мл. Промывают ооциты от посторонних клеток в той же среде и помещают во флакончики с теми же компонентами. Затем во флакончики с клетками, находящимися в культуральной среде. добавляют 20 фетальной сыворотки и мозговой нейритстимулирующий белок в различной концентрации: от 50 до 375 нг/мл. В качестве контроля одновременно в одном опыте берут ооциты и культивируют в той же(57) Изобретение относится к области экспериментальной эмбриологии млекопитающих и биотехнологии, Целью изобретения является повышение созревших ооцитов с неповрежденным генетическим аппаратом. Для этого культивирование ооцитов осуществляют одновременно с клетками гранулезы, в культуральной среде ТСс 20 фетальной сыворотки, используя в качестве полипептидного фактора роста мозговой нитритстимулирующий белок в концентрации 100 - 250 нг/мл. 3 табг среде, но только в присутствии 20 фетальной сыворотки без факторов роста. Флакончики с клетками помещают в термостат для инкубирования при 37 С в атмосфере 57 ь С 02; По мере культивирования в течение 30 ч проводят. цитогенетический анализ ооци" тов на разных стадиях мейоза, т.е, подсчи- И тывают процент созревших и 0 дегенерированных ооцитов. Окрашивание и,фЬ, фиксацию клеток проводят по методу Тарковского. , ь Результаты приведены в табл. 1. Под термином ооциты всегда имеется в виду комплекс ооцитов с гранулезными клетками. Низкий уровень дегенерации ооцитов свидетельствует о благоприятных условиях культивирования клеток.П р и м е р 1, Через 5 ч культивирования ооцитов в среде ТСс добавлением 200 нг/мл МНСБ, большинство клеток, как в опытной так и в контрольной группах (80 и 85,5 соответственно) находятся на стадии диплотены, Дегенерация в опытной и конт ральной группах составляет статистически недостоверные величины (26,5 и 27,5),П р и м е р 2. 81,2 ооцитов в опытной группе через 10 ч культивирования инициировали мейоз, дегенерация при этом составляет 28,1. В контрольной группе 50;4 ооцитов на тех же стадиях развиваются, а дегенерация составляет 30.П р и м е р 3. Через 15 ч культивирования ооциты в опытной группе в основном достигают стадии метафазы(58,1), клетки с дегенерированными хромосомами составляют 22,6 против 24,1 в контроле.П р и м е р 4. 20 ч культивирования ооцитов опытной группы характеризуются синхронным вцходом клеток на стадию телофазы - 78,8 (, и достоверно меньшим числом ооцитов с дегенерированным хромосомным материаНом по сравнению с контрольной группой (21,2 против 31,1 в контроле).П р и м е р 5. Более половины ооцитов опытной группы достигают стадии метафазычерез 25 ч культивирования, в контрольной группе их число достигает 22,6 О. Продолжает оставаться достоверной разница между контрольной и опытной группами по выходу ооцитов с дегенерацией хромосом (11,8 оь в опыте по сравнению с 22,6, в контроле).П р и м е р 6. Через 30 ч культивирования 87,9 О ооцитов опытной группы находятся на завершающих стадиях развития (телофаза+метафаза ), в контрольной группе завершают свое созревание 75,7 Д ооцитов, В контрольной группе зафиксирован высокий уровень клеток с признаками хромосомной дегенерации (43,2), в то время как в опытной группе уровень дегенераций продолжает оставаться довольно низким (на уровне исходного состояния популяций ооцитов, поставленных на культивирование - 26,8 против 25 дегенерированного хромосомного материала на 0 ч - начало культивирования). В начале культивирования при выделении ооцитов и в зависимости от техники обработки, чистоты среды и дрчасть ооцитов гибнет.Таким образом, как видно из таблицы, через 25-30 ч культивирования с МНСБ ооциты достигают стадии нуклеарного созревания, т.е. более половины ооцитов достигают стадии метафазцс низким уровнем хромосомной дегенерации (пример 5, 6) по сравнению с контролем. Дегенерация в конце культивирования в опыте примерно в 2 раза ниже, чем в контроле (через 25-30 ч). Данные по определению разницы между количеством дегенерированных оацитов в начале (на 0 ) и конце культивирования (абсолютный прирост дегенерированных клеток) свидетельствует отом, что через 30 ч ооциты в 10 раэ меньшедегенерируют в присутствии МНСБ (1,8 оь в5 опыте и 18,2; в контроле).Если после завершения мейоза, т.е, придостижении ооцитами стадии метафазы(через 30 ч) оставить ооцитц в той же средекультивирования до 60 ч, то наблюдается10 резкое повышение дегенерированныхооцитов в контроле (без МНСБ) по сравнению с ооцитами в среде, содержащейМНСБ: 75 Я, в контроле и 29,6; в опцте,Этот факт свидетельствует о положитель 15 ном влиянии УНСБ на поддержание жизнеспособности клеток ооцитов в культуре.МНСБ также оказывает положительноевлияние на выход биологически полноцен-ных (по состоянию хромосом) ооцитов, син 20 хронизацию процесса мейоза, а такжепозволяет определить время, необходимоедля протекания каждой иэ стадий мейоза.Кроме того, низкий процент дегенерированнцх ооцитов в присутствии МНСБ свиде 25 тельствует также о положительном влиянииМНСБ на культуру ооцитов, на созреваниеэтих клеток.В табл, 2 приводятся данные по резуль.татам культивировачия в присутствии30 МНСБ и без него. В примерах 7 и 8 показаныстадии созревания, процент их созревания(выход созревших ооцитов) и процент дегенерированных ооцитов (по состоянию хромосом),35 П р и м е р 7, В данном экспериментечерез 30 ч культивирования почти все ооциты (88,6 оь) достигают завершающей стадиимейоза (метафазц ) в присутствии оптимальной концентрации МНСБ, причем с40 низким уровнем дегенерации (в 2,3 раза ниже, чем в контроле: 33,9 ОД в контроле посравнению с 14,87 О в присутствии МНСБ),Следует отметить, что на стадии метафазыбольшинство клеток в культуре ооцитов ока 45 эывается в значительной степени синхронизированной, т.е. большинство клетокнаходится на стадии метафаэы .П р и м е р 8, Применение а качестведобавки в культуральную среду с ооцитами50 МНСБ приводит к получению высокого процента выхода созревших ооцитов на завершающих стадиях развития(телофаза+метафаза ) 95,2 О, что на 15,2выше по сравнению с контролем (79,6%).55 Абсолютный прирост дегенерированныхклеток в опыте (с МНСБ) примерно в 7 разниже, чем в контроле (3 по сравнению с22 1 оП р и м е р 9. Мозговой нейритстимулируащий белок, влияние которого изучается10 15 20 25 30 35 40 45 50 на модели ооцитов, выделен из мозга крупного рогатого скота, представляет собой катионный гидрофобный белок с мол,мас.15000 Д. Биологическая активность МНСБ (нейритостимулирующая) сохраняется при термокислотной обработке. Белок выделен с помощью кислотной экстракции, ультра- фильтрации, препаративного электрофореэа, хроматографии на гепаринсефарозе.Таким образом, помещение ооцитов в комплексе с гранулезными клетками в культуральную среду, а также добавление туда МНСБ для улучшения условий культивирования в совокупности с цитогенетическим тестированием хромосомного, аппарата клетки, позволяет повысить информацию об уровне качества культивирования и повысить качество культивирования,В табл. 3 отражены данные экспериментов по влиянию МНСБ в разной концентрации (50 - 375 нг/мл) на созревание ооцитов на стадиях мейоэа. Состояние ооцитов оценивают по проценту созревания и проценту дегенерации ооцитое. В примерах 10 - 17 отражены данные по влиянию разных концен, траций МНСБ на качество культивирования ооцитов.П р и м е р 10. При культивировании ооцитов в среде без МНСБ через 18 ч культивирования 51,8 ооцитов продвигаются в своем развитии со стадии диплотены на стадии диакинез метафаэа 1, причем 29,6 клеток имеют признаки дегенерации,.П р и м е р 11, При введении в культуральнуюсреду 75 нг/мл МНСБ,40 оооцитов находятся на стадии диплотены, а в состоянии дегенерации 28,6 клеток.П р и м е р 12. Применение МНСБ в концентрации 100 нг/мл обеспечивает 94(-ю инициацию мейоза (диакинез+метафаэа 1) и меньшее количество ооцитов с дегенерациями хромосом (1 5,2 ).П р и м е р 13, При использовании МНСБ в концентрации 150 нг/мл все ооциты через 18 ч проходят стадию диплотены, а процент дегенерации составляет 16,2 ф,.П р и м е р 14. 95,1 ооцитов вступают в стадии диакинеза и метафазы через 18 ч культивирования в среде ТСс добавкой 200 нг/мл МНСБ, причем основная часть клеток находится на стадии метафазы 1 - 80,5. Число дегенерироеанных клеток в среде с фактором роста почти е 2 раза меньше, чем в контрольной группе (14,6;ь е опыте по сравнению с 29,6 в контроле),П р и м е р 15. 96,3 ооцитов продвигаются в своем развитии при концентрации МНСБ -250 нг/мл, достигнув стадий диакинеза, метафаэы 1, анафазы, а количество клеток с дегенерированными хромосомами при этом составляет 14,8 о .П р и м е р 16. Культивирование ооцитов в присутствии 300 нг/мл МНСБ позволяет 97,3 ооцитое достичь стадий диакинеэа и метафазы 1, у 24,3;6 клеток наблюдается дегенерация хромосом, т.е. по выходу ооцитов с признаками дегенераций опытная группа не имеет достоверных различий с контрольной (24,3 против 29,6),П р и м е р 17. Культивирование ооцитов в присутствии 375 нг/мл МНСБ уменьшает процент созревших ооцитов и резко уееличивает процент дегенерироеанных ооцитов 61 8-,ь.Таким образом, концентрация МНСБ 200 нг/мл является оптимальной, так как количество дегенерированных клеток составило лишь 14,6. Следует отметить, что оценка состояния ооцитов посозревания и дегенерации независима одна от другой, так как под термином созревания ооцитов имеется ввиду только нуклеарное созревание, а дегенерация ооцитое оценивается по самым разным признакам аномалии мейоэа, которые были перечислены ранее.формула изобретения Способ культивирования ооцитое коров, включающий забор фолликулов, выделение иэ них клеток гранулезы с последующим культивированием их в питательной среде с фетальной сывороткой, и полипептидным фактором роста, о т л и ч ею щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода созревших ооцитое с неповрежденным генетическим аппаратом, культивирование клеток гранулезы осуществляют одновременно с ооцитами, а в качестве полипептидного фактора роста используют мозговой нейритстимулирующий белок в концентрации 100-250 нг/мл,сг 1 оГлее о 9ж о ф ы о йл О л лФ .Ф Щ ф 111 Фв 1 м м О 1 -О 1 м м 1 мсч,м о аЪ ООе1 Ь с щ Ре сЧ сЧ 1 1о ее сЧ 1,е о еНЬ 9,О 9 эфЦ Я сч Ж4 ЙЦф ео13 е к о ф оф-О л а В В е-О ОСЧ 11 1 + + 1фф 1 ффсч счсч сч е- се 1 1 Фл лл а м с 1о с 11659474 Влияние .МНСБ на созревание ооцитов коров 1 культивирование в течение 30 ч, концентрация , МЧСБ 200 нг/мп) Показатель Контроль Опыт Количество ооцитов Созревшие ооциты настадиях, 7:диплотендиакинезметафаз 1анафазтелофазметафаз 11 Дегенерированные ооциты, Е:на 0 ч 11,8 11,8+22, 1 Примечание. - Не было обнаружено клеток, " Так же, как и в табл.1, приведены данные по культивированию ооцитов в.течение 30 ч, но отличия цифровых данных по проценту созревших и дегенерированных ооцитов на стадиях мейоза зависит от состояния исходной популяции. Разница между количеством дегенерированных ооцитов в начале и конце культивирования.Таблица 3Влияние ИНСБ на созревание ооцитов коров (выбор олтимальной концентрацииИНСЫ, время культивирования 18 часов) 1 Концентрация ИНСВ,нгlмп КапичестДегенерированные ооциты, Х Созревшие ооцнты на стадиях, Е