Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

(9) 5/00С 12 И 11/00 4 (531 нул при аствора аническ грануование что, улучш ктерис аботку нияик цегранултвораными м новременно саствора желатиннем гранулы дотывают восстана испергированием р перед сепарирова олнительно обрабаРь ОО ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получение желатиновых гргировании водногона в неполярном орворителе, обработкгидами и их сепарич а ю щ и й с я тупрощения процессатехнологических халевого продукта, опроводят 1,4-1,757.и диальдегидов од ливающими реагентами. диспер- желатим раст- диальдео т лис целью11615Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению микроносителей для иммобилизации и вцращизавия клеток, рост которых вазможен на поверхности носителя. Использование микроносителей для культивирования позволяет выращивать значительные количества клеток в одном реакторе, уйеньшает трудоемкость процесса, позволяет достичь . 0 большей стерильности и тем самым открывает возможности использования методов выращивания клеток в промышленных масштабах.Для культивирования клеток ис пользуются различные микроносители, в частности, на основе декстрана, модифицированного коллагеномНедостатками микроносителя являются двустадийность его синтеза, 20 невозможность его использования для культивирования некоторых типов клеток, а также ухудшение его характеристик при повторном использовании, 25Наиболее близким к предлагаемому ао технической сущности и достигаемому положительному эффекту являет. ся способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе (хлороформ-толуол), обработку гранул диальдегидами (глутаровым альдегидом)55 н их сепарирование.Способ предусматривает раздельное проведение всех стадий, двухкратное сенарирование, использование высоких концентраций глутарового альдегида 2),40Недостатками способа являются его миогостадийность, сложность, большой расход глутарового альдегида и недостатки целевого продукта (окрашиааннв геля прн микроскопнровании,45 неспецифическая сорбцня но свободным альдегидным группам). Цель изобретения - упрощение процесса и улучшение технологических 50 характеристик целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу папучения желатиновых микроносителвй для . культивирования клеток, включающему 55 получение желатиновых гранул при .диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом 48 2растворителе, обработку гранулдиальдегидами и их сепарирование,обработку гранул проводят 1,41,752-ными растворами диальдегидоводновременно с диспергированием раст-,вора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.В качестве диальдегидов можноиспользовать глутаровый альдегид,диальдегид азелаиновой кислоты, глиоксаль, терефталевый диальдегнд.Обработка протекает в среде различных неполярных органических растворителей (машинного, трансформаторногомасла, изооктана, толуола, ксилола,бензола, хлороформа и др.) с последующим отмыванием реакционной средыи последующим фракционированием, выделяя частицы микроносителя с опти"мальными размерами 100-250 мкм. В качестве восстанавливавяцих реагентовиспользуются реагенты, восстанавливанщр. С=И связи и альдегидные группы, например боргидриды щелочных металлов, перекись водорода, атомарныйводород, дитионит (гидросульфит) натрия и др.Использование предлагаемого способа обеспечивает упрощение процесса получения носителя: уменьшаетсястадийНость способа получения микроносителя (отпадает необходимость встадиях выпаривания, повторного автоклавирования и приготовления трехкомпонентной смеси), упрощается состав реакционной среды (вместо трех"компонентной смеси по известномуспособу в предлагаемом используетсяоднокомпонентная система); уменьшается общая продолжительность проведения процесса, уменьшается расходпоперечно сшивающего агента (вместоиспользования 20 мп 253-ного раствора глутарового альдегида на 1,5 гжелатина по известному способу впредлагаемом способе на такое жеколичество желатина используетсяЭ мл 25-ного раствора глутаровогоальдегида),Использование предлагаемого способа позволяет заметно улучшить также качество микроносителя: обработка восстанавливающим рвагентом позволяет обесцветить частицы носителя (тви самым улучшаются его технологические качества) и облег- ф чает непрерывный анализ роста кле-,161548 4 счете на сухое вещество) 1 ОЖ желатина.П р и м е р 2. 200 мл 253-кого раствора желатина, полученного прн450 С, суспендируют в 1 л смеси сос" тоящей из трансформаторного масла и изооктана (1;1 по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к смеси 0 прибавляют 75 мл 253-ного раствораглутарового альдегида и перемешивают еще 20 мин. Затем микроносительотфильтровывают на сите 100 мкм ипромывают иэооктаном, горячей водой 5 в присутствии поверхностно-активныхвеществ.н еще горячей водой. Полученный носитель заливают 500 мл102-ного раствора перекиси водородаи выдерживают 0,5 ч, затем фильтруют,промывают водой и фракционируют,отбирая фракцию с размерами частиц100-250 мкм. Получают 260 г влажногомикроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 187 желатина.П р .и м е р 3. 200 мл 202-ного раствора желатина полученного прио50 С,сусенднруют в 1 л ксилола и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мнн, Затем, не останавливая мешалку, прибавляют 75 л 253-ного глутарового альдегида н перемешивают еще 5 мин, Иикроиоситель отфильтровывают на сите 100 мкм, промывают петролейным эфиром, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веЭО 35 П р и м .е р 1. 400 мл 157-ного. раствора желатина,полученного при504 С, суспендикуют в 2 л смеси,состоящей иэ машинного масла инэооктана ( 1: 1.по объему), и интенсивно перемешивают при комнатнойтемпературе в течение 3 мин, Затем,не останавливая мешалку, к смесиприливают 150 мл 253-ного раствораглутарового альдегида конечная)концентрация 1,463 и перемешиваютеще 20 мин. После этого носительотфильтровывают на сите 100 мкм ипромывают иэооктаном,горячей водойв присутствии поверхностно-активных 50веществ, горячей водой, Полученныймикроноситель заливают 1 л 2 Х-ногораствора боргидрида натрия и видераивают 0 5 ч, затем фильтруют, промы. вают водой и фракцноннрувт, отбирая Я ,ра глиоксаля (конечная концентрвфракцию с рвэмерамн частиц 100250 мкм. Получают 540 г влаайогомнкроносителя, содераащего (в пере"ФВ: жг Э мерами частиц 100-250 мкм, Попучают 200 г влажного мнкроносителя,содержащего (в пересчете на сухоевещество) 1 ВХ желатина. П .р н м е р 4. 200 ип 203"ногораствора аелатнна суспенднруют в.1 л ксилопв и интенсивно перемеши-.вают в течение 3 мнн. Затем, неостанавливая мешалку, к суспенэинприбавляют 50 мп 353"ного раствоцня 1,4 Ц и нервмееввйют еще 5 мнн. Далее обрабатывают согласно примеру 2. Получают 195 г инкроносителя,соз 1ток на микроносителях; обработкавосстанавливающим реагентом позволяет удалить несвязанные альдегидные группы и тем самым увеличить специфичность взаимодействияносителя с клеткой использованиеусловия получения микроносителяпозволяет получить носитель, который стабилен не только при комнатной температуре (20-25 С), но ипри более высоких температурах,что облегчает проведение различныхопераций (стерилизации, дальнейщего модифицирования) с ним.Согласно предлагаемому способуполучен микроноситель с плотностьюи прозрачностью, близкой таковым уводы, значительной химической имеханической стабильностью, с размерами частиц, обеспечивающими оптимальный рост клеток и шарообразной формой микросферы, обсспечивающей быстрое прикрепление клеток кповерхности мнкрокосителя и эффективный рост и распластывание клеток самого различного типа, Полученные микроносители не разрушаются обычными культуральныии средамии поэтому они могут быть использованы многократно, Рост культур клеток на них можно осуществить какв статических условиях, так и суспензионным методом в динамическихусловиях, т.е. в условиях глубинного культивирования клеток,ществ и чистой горячей водой. Полу"ченный микроноснтель заливают 500 мл .0,5 Ж-ного раствора гидросульфитанатрия н выдерживают 1 чф затеифильтруют, промывают водой н фракционируют, отбирая фракцию с раз 1161548держащего 17% желатина (в пересчетена сухое вещества).П р и м е р 5. 200 мл 20%-ногораствора желатина суспендируют вл смеси, состоящей из машинного 5масла и изооктана (1:1 по объему),иинтенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин.Затем, не останавливая мешалку,к суспензии прибавляют 50 мл 40%-ного раствора терефтальевого диальдегида (конечная концентрация 1,6%)в диоксане и перемешивают еще60 мин, Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой вприсутствии поверхностно-активныхвеществ и еще раз горячей водой.Полученный материал заливают 500 мл8%-наго раствора перекиси водорода ои выдерживают 0,5 ч, фильтруют,промывают водой и фракционируют,отбирая фракцию с размерами частиц100-250 мкм. Получают 180 г микроносителя, содержащего 17% желати- ф 5на (в пересчете на сухое вещество) .П р и м е р б. 200 мл 20%-ного желатина суспендируют в 1 л смеси, состоящей из машиннога масла ииэооктана (1:1 по объему), и интенсивна перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 80 мл 28%-ного раствора свежеприготовлепного диальдегида азелаиновай кислоты (конечная концентрация 1,757) и перемешивают 20 мин. Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз водой, Гранулы заливают 500 мп 8%-ного раствора перекиси водорода и выдерживают 0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размером частиц 100-250 мкм.Получают 190 г микроносителя с содержанием 17% желатина (в пересчете на сухое вещество).Микранасители, полученные согласно примерам 1-6, содержат 10-18% желатина (в пересчете на сухое вещество) имеют сходные свойства и могут быть применены (для размио" жения клеток) с одинаковым успехом,Выращивание различных типов клеток на предлагаемых микроносителях протекает следующим образом.10 мл плотного осадка микро- носителей (предварительно стерилизованных автоклавированием), что обеспечивает культуральную поверхность около 2500 см, и 40.20 све 6 жеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста суспендируют в 100 мл питательной среды 199 с 0,157, гидролизата лактальбумина, 5% телячьей сыворотки, 0,17 галактозы, 20 мм буфера НЕРЕБ (рН 7,4) и антибиотиками.Культивирование проводят в сосуде объемом 250 мл с подвешенной мешалкой при 37 С, В первые сутки культивирования число оборотов мешалки составляет 10 об/мин, на вторые и третьи сутки-30 об/мин и далее 50-60 об/мин. Через 48 ч культивирования заменяют 50-707 среды на свежую, Спустя 4-5 сут после начала культивирования на частицах микроносителей формируются плотные культуры клеток куриных эмбрионов, Концентрация клеток к этому времени достигает (2,610,3) млн. кл/мл, т,е. за 4-5 сут их число возрастает в среднем в 6,5 раза.Клетки почек зеленых мартышек (КПЗМ) первого субпассажа культивируют на микроносителях в условиях, аналогичных описанным в примере 1, с той разницей, что посевная концентрация клеток в данном примере составляет 1,5 10 кл/мл, концентрация сыворотки 107.Через 4-5 сут культивирования концентрация клеток достигает (1,510,22) млн, кл/мл, возрастая в среднем в 10,8 раза.Клетки диплоидной линии Мэмбриона человека, взятые на уровне 24 и 28 пассажейвыращивают на микроносителях, как описано выше, с той разницей что вместо среды 199 используют основную среду Игла. Через 5 сут культивирования число клеток увеличивается в среднем в 7,6 раза, концентрация клеток при этом достигает (1,1410,11) млн кл/мл.Таким образом, преимущества при использовании предлагаемого способа заключаются в том, что он проще известного в осуществлении: меньше стадий, однокомпонентная система,Составитель В. МуронецТехред А.Бабинец Корректор А. Зимокосов Редактор Н. Киштулинец Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1 13035,Москва, Ж, Раушская наб д. 45Заказ 393831 Филиал ППП "Патент", гужгород, ул, Проектная,4 уменьшена продолжительность, процесса;позволяет экомить сырье (уменьшен расход глутарового альдегида); улучшить качество целевого продукта так как полученный микроноситель стабилен в широком диапазоне температур (до 120 С), не содержит сво- т 1161548 8бодных альдегидных групп) которые обуславливаот неспецифическую адсорбцию компонентов среды), прозрачен (что позволяет проводить визуальз ный контроль культур клеток на микроносителях) ,может быть использован для выращивания клетокмногократно.