Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 12 М 5 0 НЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ ГОСУДАРСПО ДЕЛ ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТН АВТОРСКОМУ СВИДЕ"ГЕПЬСТВУ 1 Г 4 ЛИОГЛЫА(56) Н 1 воп К., МовЬасЬ К, - РЕВА1 е 1. 1980, чо 1,118, р.145.Авторское свидетельство СССРУ 1161548, кл. С 12 й 5/00, 1983 4) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ КРОНОСИТЕЛЕИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯЛЕТОК, включащий получение частиц из желатинового геля, обработанногопоперечно-сливающими реагентами-диальдегидами и стабилизацию гранул добавлением восстанавливающих реагентов,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения выхода и улучшениякачества целевого продукта, частицыгеля обрабатывают 0,25-0,757-нымраствором протеолитического ферментаживотного происхождения при объемныхсоотнощениях раствора фермента к желатиновому гелю 0,75-1,25;1, а переддобавлением восстанавливающих реагентов проводят вторичную обработку диальдегидами.О 5 20 25 30 Изобретение относится к области биологии и микробиологической промышленности, в частности к выращиванию поверхностно-зависимых животных клеток.Пель изобретения - увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта.Сущность способа заключа.ется в том, что частицы желатинового геля обрабатывают протеолитическими ферментами животного происхождения (0,25-0,75% в ,ный раствор протеолитического фермента при объемных соотношениях раствора фермента к желатиновому гелю (0,75-1,2 Я:1 а после этого проводят вторичную обработку диальдегидами.Продавливацне желатинового геля через сита опрецеленного размера с последующей обработкой частиц протеолитическим ферментам обеспечивает получение микроносителей определенного размера неправильной овальной формы с ровной поверхностью. Данная технология обеспечивает получение частиц определенного заданного размера с незначительной дисперсией беэ этапа их сепарации, что в значительной сто; пени облегчает процесс получения микроносителей. Этот прием позволяет получить микроносители, не применяя этапа суепензионной полимеризации гидрофильных материалов в гидрофобной среде реакции, что в значительной степени ускоряет получение микроносителей с одновременным улучшением их качеств, например для получения гранулированных микроносителей способом суспензионной полимеризации требуется применение дорогостоящего оборудования (ферментеры, гидрофобной реакицонной смеси(по известнсму способу - 3-компонентная смесь), сформировавшиеся частицы необходимс освобождать от компонентов реакционной смеси путем промывки в органических растворителях и растворах детергентов, полученные способом суспензионной полимеризации частицы неизбежно имеют вкрапления реакционной среды, что ухудшает качество микроносителей. Предлагаемый способ свободен от перечисленных недостаков,П р и м е р 1. Приготовление микроносителей.Смешивают 400 мл 25%-ного водйого раствора желатина, полученного при 50 С, со 150 мл 25%-ного водного раствора глиоксаля и интенсивно перемешивают при комнатной температуре 1 мин. Через 10 мин блок желатинового геля продавливают через сито с диаметром отверстий 250 мкм. Полу- ценные частицы (диаметром не более 250 мкм) обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе (йБ), рН 7,б,в течение 10 мин в соотношении 550 г частиц геля/0,5 л раствора трипсина при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого частицы геля промывают 0,15 М раствором БаС 1 для удаления трипсина и растворимых продуктов ферментативного расщепления желатинового геля. К отмытым часгицам добавляют 100 мл 25%-ного раствора глиоксаля и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор глиоксаля фильтрацией на сите с диаметром отверстий 100 мкм частицы суспензируют в 1 л 3%-ного водного раствора перекиси водорода и выдерживают так 30 мин, после чего микроносители промывают раствором 0,15 М 11 аС 1. Суспендированные в 0,15 М растворе 11 аС 1 микроносители стерилизуют автоклавированием приО120 С в .течение 15 мин. П р и м с р 2, Приготовление микроносителей,Смешивают 200 мл 35%-ного водногораствора желатина, полученного прио50 С, с 700 мл 25%-ного водного раст-,вора глутарового альдегида и интенсивно перемешивают при комнатной температуре 1 мин. Через 10 мин блок желатинового геля продавливают черезсито с диаметром отверстий 200 мкм,олученные частиць диаметром не более 200 мкм обрабатывают 0,5%-нымраствором коллагенаэы в 0,15 М ФБ втечение двух минут, при соотношении270 г частиц геля/230 мл раствораколлагеназы при 37+ С и постоянномперемешивании. Затем частицы промывают 0,15 М раствором МаС 1. Отмытыечастицы обрабатывают последовательио в 130 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида - 10 мин при комнатной температуре., 0,15 М растворомЯаС 1 для удаления непрореагировавшего сшивающего агента, в 0,5 л2%-ного раствора боргидрата натрия30 мин при комнатной температуре,обильно промывают водой до нейтраль 748ной рН промывной жидкости. После этого микроносители ресуспендируют в0,5 л 0,15 М раствора ИаС 1,через10-15 мин промывают свежей порциейизотонического раствора 1 аС 1 и стеарилизуют автоклавированием при 120 Св течение 15 мин,П р и м е р 3. Приготовление микроносителей.Микроносители получают так же, как 0в примере 2, но используют 207-ныйраствор желатина, в качестве протеолитического агента - 0,757-ный раствор химотрипсина, в качестве во".становителя - ЗБ ный раствор НО, 15П р и м е р 4. Желатиновый гель,полученный по примеру 1 ( л), обрабатывают 0,75 л 0,257-ного растворатрипсина в 0,15 М фосфатном буферномрастворе, рН 7,6, в течение 10 минопри 25 С и при постоянном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру 1 и получаютл микроносителя.При выращивании клеток почек зеленых мартышек (КПЗМ) по примеру 5 ихконцентрация через 4-5 сут достигает1,5+0,2 млн/мл, возрастая в 1 О раз. П р и м е р 5. Желатиновый гель, полученный по примеру(1 л), обрабатывают 1,25 л 0,757.-ным раствором химотрипсина в 0,06 М фосфатном буфере, рН 6,4, в течение 12 мин при 20 С и при постоянном перемешивании. Гель35 далее обрабатывают по примеру 1 и получаютл микроносителя. При выращивании клеток КПЗМ по примеру 5 их концентрация через 4-5 сут достигает 1,50,2 млн/мл, возрастая в среднем в 1 О раз.Микроносители, изготовленные согласно описанию, приведенному в примерах 1-5, имеют практически одинаковые свойства; они представляют собой 45 механически, химически и термически стойкие частицы необходимого диаметра например, 100-250 мкм из поперечносшитого денатурированного коллагена, обеспечивающего биоспецифическое взаимодействие с клетками. Частицы микроносителей, полученных согласно описанию, приведенному в примерах 1-5, имеют овальную форму, гладкую поверхность, отлично подходящую для прикрепления, распластывания и роста клеток, удельный вес и коэффициент преломления света, примерно равные таковым у воды,и могут с равным успехом быть применены для вырашивания клеток различных типов.П р и и е р 6. Выращивание первичных клеток куриных эмбрионов на разработанных мцкроносителях.18 мл плотного осадка микроносителей, обеспечивающих культуральную площадь около 5000 см , суспендируют в 50 мл соленого раствора Хенкса. Через 1 О мцн солевой раствор Хенкса сливают, а микроносители ресуспендируют в 50 мл пцтательной среды 199 с 5 сыворотки телят, 0,257 гидролизата лактальбумина, 0,17 галактозы, 20 мМ буфера НГРЕ 8 и антибиотиками, и суспензию переносят во флакон объемом 250 мл с подвешенной мешалкой (спиннер) . К суспензиц микроносителей добавляют 50 мл первичных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста (клеткц суспендцруют в среде указанного состава) и во флакон добавляют питательную среду до объема 100 мл. При этом посевная концентрация клеток составляет 0,5 млн/мл, а концентрация микроносителей обеспечивает культуральную площадь около 50 см/мл,оКультивирование проводят при 37 Си плавном перемешиваниц суспензии микроцосцтелей: в первые сутки культи - вирования со скоростью 10 об/мцн, во вторые и третьи - 20 об/мин, а далее 50-60 об/мин, Начиная со вторых суток культивирования, ежесуточно проводят замечу части среды; на вторые и третьи сутки - 507. объема среды, далее 707 объема среды, Спустя 5-6 сут после начала культивирова. ния, на частццах микроносителей формируются сливные культуры первичных клеток куриных эмбрионов. Плотность культур к концу срока культивирования (6 сут) достигает 5,80,3 млн.кл/мл, т,е. число первичных клеток куриных эмбрионов возрастает в11 раз за 6 суток,Подсчет числа клеток, выросших на микроносителях, проводят по следующей методике. После окончания куль-, тивирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендируют микроносители), После оседания микроносителей в пробе надосадочнуюжидкость сливают, а культуры на микроносителях несколько раз промывают 0,15 М фБР. Культуры на микроносителях обрабатывают по методу подсчета ядер клеток.П р и м е р 7. Выращивание вторич ных клеток почек зеленых мартышек на разработанных микранасителях.Вторичные клетки почек зеленых мартышек КПЗМ вносят н концентрации 210 кл/мл в суспензио разработанных микроносителей, которые используют в концентрации 5,5 мл гшотного осадка на 100 мл среды, что обеспечивает культуральную площадь около 15 см /мл. Применяют питательную сре-. ду следующего состава: максимальная среда Игла (МЗМ) с 10% сыворотки телят, 0,257, гидролизата лактальбумина, 0,1% галактазы, 20 мМ буфера НЕРЕЯ и антибиотиками. 350 мл сус - пензии микроносителей и клеток в питательной среде вносят в спицнер объемом 1 л. Культивирование провоодят при 37 С и плавном перемешивании суспензии: О об/мин - первые сутки мешалку включают на минуту через каждые 40 мин в течение б ч после засева клеток, затем мешалка работает постоянно), 20 об/миц - вторые и третьи сутки культивирования и далее 50-60 об/мин. Через 72 ч и терез 120 ч после начала культивирования проводят замену соответственно ЗО и 707 среды на свежую. Через б сут культивирования почти на всех частицах микранасителей наблюдают плотные культуры"клеток. К этому времени кон.- центрация клеток достигает 38 млн/мл П р и м е р 8. Длительное культивирование клеток на разработанных микронасителях.Вторичные КПЗМ выращивают так же, как в примере 7. После формирования плотных культур микроносители переносят в роллерные бутыли объемом 0,5 л, внутренние стенки которых предварительно силиконизируют. В каждую бутыль вносят по 175 мл суспензии микроносителей с выросшими культурами. 1(ультивирование процолжают при 37 С при 10 об/мин, в среде такого же состава, как описано в примере 5, но с пониженной до 37 концентрацией сыворотки. Дважды в неделю заменяют 507 среды на свежую. Еженедельна проводят пОдсчет клеток па методике, указанной в примере 6, и микроскаттиронание взятьгх образцовкультур на микроносителях,. Наблюдение показывает, что клетки на протяжении 9 недель (срок наблюдения) остаются прозрачными, сохраняют чет П р и м е р 1 О. Выращивание клетокциплоидной линии на разработанныхмикроносителях.зО Диттлоидные клетки М, полученной из тканей эмбриона человека, выращивают на разработанных микроносителях так же, как в примере 7, с той разницей, чта посевная концентрацияклеток в данном случае составляет Э.Э310 кл/мл. Через 4 сут культивирования количество клеток достигает 1,8 млн/мл, т,е. но.-растает в 6 раз за 96 ч, при э:ом большая часть час 1 О г. 20 25 ЗО 35 д 0 кие границы и типичную для них форму, не атслаиваются от микроносителей, Число клеток на протяжении всего времени наблюдения сохраняется на уровне (3,6+0,36) млн/мл.П р и м е р 9. Выращивание клеток перевинаемой линии ча разработанных микроносителях н среде с обычной и с пониженной концентрацией сыворотки.На разработанных микроносителях, взятых в концентрации 5,5 мл плотного осадка 100 мл среды 15 см /мл), выращинант клетки линии 4647, полученной из почек здоровой взрослой мартышки. Посевная концентрация клеток линии 4647 составляет 15 1 О кл/ /мл. Используют питательную среду такого же состава, как в примере 7, но н одном случае среда содержит 10% сыворотки, а н другом - 17. сыворотки телят. В обоих случаях в среды добавляли пируват Ма до концентрации 10 мМ и метилцеллюлозу до конечной концентрации 0,3%. Для равнения такие же культуры клеток выращивают на поверхности стеклянных плоскодонных флаконов объемом 0,1 л, Посевная плотность культур клеток во флаконах такая же, как и в культуре на микроносителях: 10 О /см . При куль 3 2 тиниронании клеток в средах с обычной и пониженной концентрацией сьтворотки обычными методами (на стеклянной поверхности) и на разработанных микроносителях кол.тагеновый субстрат)показано, что при всех прочих равных условиях урожай клеток, выращенных на. поверхности стекла при использовании питательной среды с 107. сыворотки, составляет 80,27, а при использовании среды с 17 сыворотки достигает 42,27 от урожая клеток, выращенных на. разработанных микроносителяхЗаказ 2723/19 Тираж 499 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная, 4 тиц микроносителей покрыта сливным слоем клеток.П р и м е р 1Сбор клеток, выращенных на разработанных микроносителях. 5Первичные клетки эмбрионов выращивают так же, как в примере 6. После окончания культивирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендировав микроносители) и проО водят подсчет клеток, как в примере 6. Подсчет клеток показывает, что их концентрация достигает 5,7 млн/мл, Остальные микроносители после отмывки от питательной среды ресуспенди руют в 50 мл 0,15 М и ФБР, содержащего 0,253 трипсина и 0,02 7 ЭДТА. Через 5 мин надосадочную жидкость осторожно сливают, микроносители с клетками инкубируют в оставшемся ко личестве диспергирующего раствора в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого к суспензии микро- носителей добавляют ФБР с 0,5 Е гидролизата лактальбумина и флакон 25 несколько раз энергично встряхивают. Отслоившиеся от микроносителей клетки подсчитывают с помощью гемоцитометра (камера Фукс-Розенталя). Количество клеток при этом составляет 30 5,25 млн/мл.П р и м е р 12. Желатиновый гель, и-лученный по примеру 1 (1 л), обрабатывают 0,6 л 0,203-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буфер ном растворе, рН 7,6, в течение 1 Оо10 мин при 25 С и постепенном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру . При выращивании клеток КПЗМ по примеру 5 на полученном геле 40 концентрация клеток через 4-5 сут достигает 0,17 ф 0,02 млн/мл, возрастая в 1,1 раза, т,е. рост практически не наблюдается.П р и м е р 13. Желатиновый гель, 45 полученный по примеру 1 ( л), об 48 8рабатывают 1,5 л 1".-ного растворатрипсина в О,5 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение1 О мин при 5 С и постоянном перемеошивании. Во время обработки желатиновый гель полностью растворяетсяи получить микроноситель не удается.Таким образом, улучшение качества предлагаемого микроносителя посравнению с микроносителем, получаемьи по известному способу, достигается более высокой чистотой продукта,получаемого по предлагаемому способу: в этом микроносителе отсутствуют примеси среды поликонденсации(масла, углеводородов) . Частицы микроносителя,получаемые методом дисперсионной поликонденсации,содержатпримеси реакционной среды, которая вдальнейшем оказывает токсическоевоздействие на клетки. Улучшение качества микроносителя, получаемого попредлагаемому способу, достигаетсятакже тем, что предлагаемый способобеспечивает более высокую однородность фракционного состава микроносителя (98 Х частиц с размерами 180200 мкм). Микроноситель, получаемыйпо известному способу, является менее однородным 175-803 частиц с размерами 100-250 мкм),Кроме того, частицы, полученныепредлагаемым способом, имеют болееоднородный состав, так как их размеропределяется диаметром отверстиясита, через которое продавливаютгель. Во всех известных способах необходима стадия фракционирования частиц по размерам, при которой отходгранул геля составляет 70-8 ОЕ. Следовательно, предлагаемый способ коренным образом изменяет технологиюполучения микроносителей и позволяетполучить высококачественный и болеедешевый продукт, причем с более высоким выходом.