Способ получения биотинузнающего реагента и способ обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 80,1)5 С О 1 М 33/53) С ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТЕЛЬС к двтси момг с 8 еменном упрощении и а его получения иба обнаружения биоиологическнх макроранении высокогости анализа,агаемому способу в тся новый биотинуэацетилированный ави от применяемого для ента при одновр скорении процес Изобретени лярной биолог может найти ш всех видах ра идентификацию относится к молекуи и биотехнологии и рокое применение во от, предполагающих биологического матерна аких современных метоодиагностика и гибриалиэ,етения является улучбиотннузнающего реае.спосток впри социфичн ешевлен тиновыхмолекула уровня с Соглао анализе исполь изационной,а Целью иэо ние качествающий реагентин, отличающийс ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР и Научнои 11производственное объединение .Биолар(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНУЗНАЮЩЕГО РЕАГЕНТА И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ БИОТИНОВЫХ МЕТОК В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛАХ(57) Изобретение относится к молеку-, .лярной биологии и биотехнологии и может быть использовано во всех видахработ, предусматривающих идентификацию биологического материала такимиметодами, как иммунодиагностика и гибридиэационный анализ, Цель изобретения - улучшение качества биотинузнающего реагента при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения и удешевление способа обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах при сохранении высокого уровня специфичности анализа,Это достигается благодаря использованию нового биотинуэнающего реагентаацетилированного авидина, отличающегося высокой биотинсвязывающей активностью, низким уровнем неспецифической сорбции и сравнительно низкой себестоимостью вследСтвие полученияего из доступного и относительно дешевого сырья при помощи предложенногонесложного способа синтеза, Анализ,основанный на применении ацетилированного авидина позволяет определять 3биотинированную нуклеиновую кислотув количестве 110 г, По специфич-(йности распознавания биотиновой метки описываемый способ не уступает наи.ИЪболее совершенному из известных методов, в котором в качестве биотинузнающего реагента применяю 1 г стрептавидин, и является при этом значитель-,но более доступньм и дешевьи, 2 с,п,ф-лы, 6 табл,1557528 Таблица 1 Опыт Концентратепень моднфиации (Е уа 0 /Ко го анг.идипа М Оь 05 0,07 0,10 0,15 0,01 Оь 005 1,45 1,45 2 3 1,45 1,45 1,.05 0,99 7 (беэ ме%Потеря биоти, Реакциснижение ч н с бел о- на м, предлагаемый биотиновой мет соб тех жецелей сукцинилированногоавидина более низким уровнем неспецифической сорбции, а также более простым и быстрым способом получения,Предлагаемый способ получения био,тинузнающего реагента заключается втом, что авидин инкубируют 25-30 минс 0,05-0,1 М раствором уксусногоангидрида в буфере с рН 6,7-6,9 вприсутствии 1-мегилимидазола в качестве катализатора и выделяют полученный продукт гель-хроматографией.В результате реакции ацетилирования "гасятся". положительные зарядыаминогрупп белка и снижается егоиэоэлектрическая точка, однако в отличие от сукцинилированного авидинаацетилированный не приобретает новыхиониэированных (отрицательно заряженных) групп, что дает ему преимущество при анализе положительно заряженных макромолекул, Условия реакции ацетилирования подбираются такимобразом, чтобы блокирование сильноосновных групп белка не затрагивалоостатки, входящие в активный центри отвечающие за связывание с биотином, и, следовательно, не приводило к снижению биотинсвязывающейактивности, что наблюдается пои получении сукцичилированного авидина,При выделении ацетилированногоавидииа сокращается общее количествоопераций, в результате чего общее;время его синтеза и очистки состав 35ляет 3-4 ч (против 1,5-2 сут длясукцинилированного производного),Новый биотинуэнающий реагентацетилированный авидин -.по своим40основным качествам (биотинсвязывающей активности и специфичности взаимодействия с биотином) практическине уступает гликопротеину стрептавидину (природному аналогу белка авидина), использование которого лежит воснове наиболее чувствительных инадежных способов выявления биотиновых меток в составе биологическихмакромолекул,Однако стрептавидин получают до 50вольно сложным микробиологическимспособом, тогда как авидин, являющийся исходным сырьем для получения предложенного реагента, примерно в10 раз дешевле, получают его изка куриных яиц,1Таким образо спобнаружения ки основе применения ацетилированногоавидина, приближаясь к известному(с использованием стрептавидина) почувствительности, не уступает ему вспецифичности распознавания биотинаи оказывается значительно дешевле.П р и.м е р 1, Получение биотинуэнающего реагента,К 1,0 мл раствора авидина (1 иг/мл)в 0,1 М КН РО (рН 6,7) добавляют4 мкл 1-метилимидазола (5,2 мМ) иперегнанный уксусный ангидрид (139-140 С) в количестве 5;7;10;15;10,5 мкл (что соответствует следующим концентрациям уксусного ангидрида в смеси: 0,05; 0,07; 0,10;Ор 1 5 р Ор 01 р Ор 005 М)Затем реакцион.ную смесь инкубируют 25 мин при 20 Сьхроматографируют на колонке с сефадексом С(1 Ох 300 мм) и элюируют0,02 М .трио-НС 1, рН 7, Фракции, выходящие в свободном объеме колонки, собирают. К полученному раствору биотинуэнающего реагента добавляют ВаС 1до концентрации 0,1 М и ВаБО до кон-.центрации Оь 1 Ж и хранят при -18 С.Потери активности препарата не наблюдается в течение 4 иес,Результаты модификации авидина взависимости от концентрации уксусногоангидрида в растворе приведены втабл,1,1,05вязывающей активносотекает не до конца, вительности. П р и м е р 2, Получение бизнающего реагента,.Модификацию авидина проводят ана огично описанному в примере 1 при онцентрации уксусного ангидрида(Егзо/Еаьо) Опыт рН буфера 89101112 1,45 1,45 1 ф 45 1,40 1,05 9,9 6,9 9,9 7,2 9,5 Ф Не достигается максимальная степень модиФикации,П р и м е р 3. Получение биотинузнающего реагента,Модификацию авидина проводят аналогично описанному в примере 1 приконцентрации уксусного. ангидрида0,05 М и рН буфера 9,7, но время инкубации меняют в пределах 20-35 мин,Степень модификации авидина в зависимости от времени инкубации при. ведена в табл.3. 3 5 150,05 М, но рН буфера изменяют в пределах 9,5-7,2,Степень модификации авидина взависимости от рН буфера приведенав табл,2,Т а б л и ц .а .2Количество,опреде ляемой ви Соотношептичесние синал/шум аялотностьри 440 нм,(о,е.) усной гНК,10 г 57528 6ляют раствор биотинированной пероксидазы (1 мкг/мл), вновь промывают буфером А два раза по 3 мин и водой во5течение 3 мин при 22 С для отмывкинеспецифически связавшейся пероксидазы, Пероксичазную активность проявляют в ячейках планшета для иммуноанализов в 0,1 М БНАс (рН = 5,8) вприсутствии О,ОЗЙ перекиси водородаи 0 17 о-фенилендиамина в течениео1 ч при 22 С, О наличии искомой нуклеиновой кислоты судят по результатамизмерения оптической плотности полученного комплекса при 440 нм, Общеевремя анализа составляет - 1,5 ч,Для определения чувствительностипредлагаемого метода и его калибровкисодержание вирусной РНК предваритель 20 но определено методом радиоактивноймолекулярной гибридизации.Результаты определения различныхколичеств вирусной РНК приведены втабл,4,Таблица 4пыт Время инк бации (мителень мо кации Еезо Емо)1,45 1,45 1,30 1,45 20 35 ФРеакция идет не до конц Нецелесообразно,так как заканчивается за 25-30 к Пример 4,новой метки в РНКствительносгн анап явление би пределение иэа,Суимарную РНК из мозга.,мыши, держащую 0,05-0,1 Х биотииирован РНК вируса клещевого энцефалита мобилизованную на ннтроцеллюл фильтре, обрабатывают раствором тилированного авидина (1 мкг/мл 0,5 М КС 1, 0,02 М трис-НС 1, О,О МС 1 рН 75 (буфер А) 5 мин при 22 С, Затеи носитель промыв буферои А два раза по 2 мин и д0,04 0,72 0,47В18125,52,5 фи 0,1 за приниНК, при За чувствитеают наименьшее ость ана количеств ние сигна ольше котором соотнош е 5, Выявлен Сравнение биотичузн е биотино ДНК специих реа вой меткорбц и нтетичес иммобилизованнь и несущий бисти вают растворомдина по примеру зультаты измер ности при 440 ДНК составили не более 0,05 роля исгользуют личестве 1 мкг) й иэйо цебав й фрагмент к-ДНК ВКЭ, й на твердом носителе новую метку, обрабатыацетилированного ави 1 (1 мкг/мл), Рения оптической плотнм при определении 2 нг о.е уровень фона,е, (в качестве контнемеченую ДНК в ко1557528 Величину неспеЦифической сорбции определяют аналогичным образом, но используя различные варианты ацетилированного авидина, стрептавидин и авидин, а в качестве тестируемого Таблица 5 Опыт(;, /Е ) Сигнал А Фон А443о,е, о,е,е Фщ ащв Узнающий реагент 1,45 1,05 1,40 1,45 0,98 0,50 0,80 0,80 0,75 0,50 0,80 0,04 0,80 0,70 0,75 0,03 0,80 П р и м е р б, Выявление биотиновой метки в белке, Сравнение ацетилированного и сукцинилированного авидина,Аналогичным образом проводят эксперименты с высокоосновиым белком - 25поли-лизином, Используют поли-лизин со степенью полимеризации 30-40несущий 1 0-1 2 бнотиновых остатков(измерено но методу вьггеснения 4-оксиазо-карбоксибензола).В качестве 30контроля используют немеченый полилизин. Для анализа используют ацетилированный авидин (опыт 1) и сукцинилированный авидин. Полученные данныеприведены в табл.б,35 таб лица 6 4Опыт Реагеит Количество поли-лизина, нг,28 Ацетилиро- ванный ави 0,50 а 50,04 дин29 Сукцинированный ави 0,80 0,40 цин Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что использование полученного предлагаемым способом биотинузнающего реагента 55 ацетилнрованного авидина - при выявлении биотиновой метки в биологических макромолекулах обеспечивает высо 22 Ацетилированный авидинматериала - фрагмент ДИК - гексадекатимидилат в количестве 10 мкг,Результаты измерений приведены втабл,5,ее т авкую чувствительность (11 0 г НК)и специфичность анализа (уровень неспецифической сорбции примерно такойже, как при использовании стрептавидина, в 10 раз меньше, чем для сукцинилированного авидина, и в 20-30 разменьше чем для авидина),Применение изобретения позволяетупростить и удешевить широко исполь-.зуемую в биотехнологии процедуруидентификации биологических макромолекул при помощи биотиновой метки,Формула изобретения 1, Способ получения биотинуэнающего реагеита, включающий инкубацию авидина в буФерном растворе с модифи цирующим ангидридом и последующее выделение целевого продукта, о тличающийс я тем, что, с целью. улучшения качества реагента за счет снижения уровня неспецифической сорбции при одновременном упрощении и ускорении процесса его получения, авидин инкубируют 25-30 мин с 0,05- 0,1 М.уксусным ангидридом при рН 6,7-6,9 в присутствии катализатора 1"метилимидаэола, а выделение Ьродук та осуществляют при помощи методагель-фильтрации1 2, Способ обнаружения биотиновых меток в биологических макромолекулах, включающий реакцию биологическо го материала, содержащего биотиновую метку, с биотинузнающим реагеитом и последовательную обработку полученного комплекса биотинироваиным Ферментом и хромогенным субстратом, о т1557528 л и ч а ю щ и Й с я тем, что, с целью удешевления анализа при сохранении высокого уровня его специфичСоставитель О,СкуратовскаяТехредЛ.Сердюкова Корректор М.Шароши Редактор Л,Веселовская Тирам 514 Подписноекомитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина,101 Заказ 716 ВНИИПИ Государственного 13035, ности, в качестве биотинузнающегореагента используют ацетилированныйавидин,