Способ определения содержания живых микроорганизмов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 9) Ш) М 5 С 12 К 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРСКОМ,Ф Х г ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно"исследовательский институт биологического приборостроения(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРРАНИЗМОВ в исследуемом образце, предусматривающий приго"товление суспенэии микроорганизмов вводной среде, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью ускорения и упрощения способа, суспенэию микроорганизмов окрашивают красителем на мертвыеклетки, ведут.,подсчет окрашенных мертвых клеток, затем суспензию инактивируют путем нагрева при 70-100 С втечение 0,5-5 мин или путем химической обработки, после чего ведут подсчет общего квличества окрашенныхмертвых клеток и па разнице двух подсчетов определяют содержание иивыхклеток в суспензии. В;101 В 970Изобретение относится к микробно"100 дС в течение 0,5-5 мин или пуогии, в частности к методам опреде" тем химической обработки., после чеголения живых микроорганизмов, и может ведут подсчет общего количества окрабыть использовано в микробиологичес- шенных мертвых клеток и по разницекой промышленности. двух подсчетов определяют содержаниеИзвестен способ определения числа 5 живых клеток в суспенэии.живых микроорганизмов путем высева Сущность способа заключается вна питательные среды с подсчетом чис" следующих операциях: добавление кла выросших колоний (1). суспензии красителя, окраска в течеНедостатками данного способа явля- ние 3-5 мин, приготовление мазка дляются длительность, составляющая от 10 счета мертвых клеток, инактивацияодного до нескольких дней, й обяза" суспенэии, содержащей краситель, втельное условие соответствия состава течение 0,5-10 мин, приготовление(",реды потребностям определяемых мик" второго мазка для счета общего коли"роорганизмов, что трудно выполнимо чества клеток, счет клеток в двухпри определении смешанных популяций 15 препаратах,микроорганизмов из ферментеров и объ" Одним из наиболее универсальных иектов окружающей среды. удобных в работе красителей на мертИэвестен способ определения живых зые клетки является флуорохром примуи мертвых бактерий путем окраски об- лин, окрашивающий клетки различныхразца красителем акридиновым оранже классов микроорганизмов. Иертвые клет"вым и подсчета числа бактерий, светя- ки дрожжей хорошо окрашиваются такжещихся красным (мертвые) и зеленым Флоурохромом тиазиновьм красным и аб(живые) светом (2. сорбционным красителем метиленовымНедостатком этого способа является синим.неоднозначность результатов, обуслов- Оптимальным режимом тепловой инак"ленная, в частности, наличием в про- тивации является нагрев суспенэии при,бах инактлвированных клеток, сохраня 100 С в течение 0,5-5 мин (Фиг. 1кщих ядерный компонент, которые окра" И 2).Применение более низкой темперашиваются красителем в зеленый цвет. туры, более короткого,и в ряде случаевНаиболее близким по технической более длительного нагрева приводит к.сущности и достигаемому эффекту яв" З 0 уменьшению степени окраски клеток.ляется способ определения содержания При этом хорошее прокрашивание инак"живых микроорганизмов в исследуемом тивированных клеток, отмечалось дляобразце микроорганизмов, предусматри- , всех трех перечисленных красителей,вающий приготовление суспензии микро- причем окрашенные клетки хорошо видорганизмов в водной среде 35 ны как в препаратах мазков, так иСпособ состоит из следующих опера" фраздавленной капли.ций мазок бактерий подсушивают на Инактивация путем нагрева удобнавоздухе, фиксируют в Фиксаторе Кар.- тем, что при небольшом времени нагренуа 20 мин, после чего снова подсуши- ва практически не меняется объем клеаают на воздухе не менее 1 ч. подсу точной суспензии, что облегчает расшениый мазококрашивают азур"зозчном чет количества живых клеток.онри 20 С в течение 24 ч, затем промы- Примером химической инактивациивают.в дистиллированной воде, подсу- . может служить обработка фенолом, коШивают на воздухе 5-10 мин, докраши- торая дает наилучшие результаты привают раствором крас.теля светлого зе- концентрации фенола б(Фиг, 3).леного 1 мин, затем удаляют остатки причем достаточно даже 30-секунднойкраски, подсушивают и микроскопируют., обработки (фиг. 4). Обработка меньшиЖивые клетки бактерий окрашиваются ми и болыаими концентрациями фенолав сине-фиолетовый цвет, а мертвые приводит к ослабленной окраске кле"клетки приобретают ярко"зеленую ок" ток, кроме того, обработка большимираску 31концентрациями фенола в случае примеНедостатками известного способа нения флуорохромсв ведет к повышению.являются большая трудоемкость и дли- люминесценции фона. Обработка феноломтельность (более 26 ч). путем добавления спиртового раствораоцелью изобретения является ускоре". или водной эмульсии приводит к хорошение и упрощение способа, 55 му окрашиванию клеток примулином иПоставленная цель достигается тем, метиленовым синим (Фиг, 3) После обчто согласно способу определения со- работки фенолом можно готовить длядержания живых микроорганизмов в ис- счета как препараты сухих мазков, так. следуемом образце, предусматривающем и фраздавленной капли.приготовление суспензии микроорганиз"69 Инактивацию можно проводить и друмов в.водной среде, суспензию микро- . гимн дезинфектантами, например спирорганизмов окрашивакт красителем на . том.мертвые клетки, ведут подсчет окра- Инактивацию путем добавления жид"Шенных мертвых клеток, затем суспен- кого химагента предпочтительнее прозию инактивируют путем нагрева при 65 водить в тех случаях, когда по раэличчым причинам нежелательна тепловая инактивацияв случае определения термофильных микроорганизмов, приналичии в пробе низкокипящих примесей и тедеИнактивация клеток в присутствии 5красителей имеет следующие преимущества перед инактивацией неокрашенныхклеток: она более экономична (требуется всего одна суспензия) и болееудобна:для автоматизации.Спороб осуществим для различных. Форму и поэтому легко были узнаваемы"е по морфологическим признакам.Количество микроорганизмов, окрашенных предлагаемым способом, можноопределять различными методамиг све."товой и люминесцентной микроскопией,автоматическим счетом на микрофотометре, или микрофлуориметре, а такжемакрометодами, в.частности Флуоримет рйей.На фиг. 5 показана калибровочнаякриваядля окрашенной примулином сус"пензия кле;ок Е.со 11 (17-часовая куль.30рура, содержащая практически одни живые клетки) до.и,после тепловой инактивации .с регистрацией флуоресценции.в кювете на спектрофлуориметре. Инактивация дает .возможность измерятв ко личество первоначально живых клетокпо приросту флуоресценции после инак"тивации и определению числа клетокпопредварительнУ построенной калиб:ровочной кривой. Люминесценция сус рпензии.мертвых клеток не. увеличивалась после .ийактивации.,Использовали .культуру. следующихвозрастов: Евспег 1 сп 1 а ео 11 - 17-часовая, Вас.11 ив Фцг 1 пфепв 1 в - 17 часовая, Яасспагопусев сегеч 1 в 1 а 124 часовая.интенсивность люминесценции от отдельных клеток в мазках на предметныхстеклах измеряли (в" условных единицах Она лкыинесцентном микроскопе с помощью фотометрической насадки и выражали в процентах по отношению .к наивысшей величине, полученной в данной серии опытов,Величину оптической плотности вычисляют по Формуле Е " в , где Х - интенсивность падаацегосвета 1 Х -. ин"тенсивность света, прошедшего черезклетку. Хо и Х измеряют на микроскопе ИЛ"2 с помощью Фототермической на-бОсадки при освещении црепарата мазкаснизу красным светом. Величину оптичесной плотности выражают в процентах по отношению к наивысшей величине, полученной в данной серии опытов На Фиг. 1 показаяа зависимостьстепени окраски клеток красителями.от температуры при тепловой инактивации: 1) Е,со 11 + примули 1 ц 2) Вас,Оип 1 пс 1 епв 1 в + .примулинЗ 3) ЯассЬ,.сегеч 1 в 1 ае +.метиленовый синий;4) ЯассЬ. сегеч 1 в 1 ае + тиазиновыйкрасный,Время тепловой инактивации " 2 мин,По оси ординат - процент устред-..ненной интенсивности. люминесценции отдельных клеток в случае флоурбхромов.,,или усредненной величины оптической.плотности в случае мегиленового.сиие-,говПо оси абсцисс - температура инак-.тивации,На фиг, 2 - зависимость .степениокраски клеток красителями от времени .теплс,вой инактивации. 1). Е,со 11 +примулин; 2) Вас, 1 Ьцг 1 пд 1 епв 1 впримулин) 3) Яассй, сегеч 1 а 1 ьа +ме".,тиленовый синий; 4) ЯассЬ,: сегеч 1в 1 ае + тиазиновый красныйтемпература .инактивации в случаеВас; Жцг 1 пу 1 епв 1 в. - 80 С, в одталь"ных случаях - 98 С,По оси ординат - то же, что и,наФиг. 1.По оси абсцисс - время инактивацйив минутах,. Нафиг.3. - зависимость степейи ок:раски клеток красителями от, концентра"ции Фенола при инактивацин 1)Е,со 11+римулин; 2) Вас. Иыг 1 пфепв 1 в +римулин; 3) Яассп. сегеч 1 в 1 ае + метиленовый синий.. По оси ординат - то же, что и иаФиг, 1.По оси абсцисс - концентрация фе-.нола в процентах.Возраст клеток - как На фнг. 1,на фиг. 4 -. зависимость- степениокраски клеток красителями от времени инактивации Феиолом: 1) е.со 11 +примулину 2) Вас. Ощг 1 рд 1 еав 1 з +нринулину 3) ЯассЬ. сегеч 1 а 1 ае + йе"тиленовый синий.концентрация:фенола в случае дрожжей - 10, в остальных случая - 7.,Но оси ординат - то же, что и наФиг. 1.По оси абсцисс .время йнактивациив минутах.Возраст клеток - как иа ФИг. 1.на фиг. 5 - зависимость флуоресцеиции суспензии 17-часовой кудьтурыЕ.со 11, окрашенной примулииом, отконцентрации клеток, до и йосле ииактивации: 1) суопензйя до инактивации2) суспензия после инактивации при9 ФС в течение 30 с.70бЪП .р и м е г 3. К 1,8 мл суспензииклеток 17"часовой культуры Вас. Юцг 1 пд 1 епв 1 в, содержащей жиь ге и мертвыеклетки, добавляют 0,2 мл раствора примуллна (1 мг/мл) на 1/15 М фосфатномбуфере рН 6,0-7,8, через 3 мин измеряют число мертвых ярко флуоресцирукгггихклеток, как указано в примере 1, за"тем добавляют к суспензии фенол в виде концентрированного спиртового раст.вора до кенцентрации 7, измеряют общее число флуоресцирукщих клеток,как указано в примере 1, и по разницемежду двумя отсчетами находят числоживых клеток,П р и м е р 4. К 1,8 мл суспензии24-часовой культуры Зассг. сегеч 1 з 1 аеусодержащей различные соотношения живых и мертвых (убитых нагревом) клеток добавляют 0,2 мл водного раство".ра тиаэинового красного (1 мг/мл),через 3 мин изйеряют число мертвыхярко флуоресцирующих клеток, как ука"эано в примере 1, затем добавляют кизмеряют общее число флуоресцирующихклеток, как указано в примере 1, ипо разнице между двумя отсчетами на"ходят число живых клеток.Результаты определения числа живых н мертвых клеток предлагаемыми контрольным способами представленыв таблице. 10189 Объект Условия обработки Количество живых клеток, В Задано всуспензиипутем смещения известных к оличеств живыхи мертвыхклеток Определено предлагаемым спосо- бом Определеноконтрольным спосо"бомг посевом на питатеьнуюсреду Определено предлагае- мым спосо бом Йесо 11 Окраска примулином, ииактивация твпломОкраска приму" лииом, инактивация фвиолом Окраска метилвновым синим ииактивация теплом 100 102 Вас.Ииг 1 п-гг 1 вв 1 вЗассЬ.свгвгг 1 й 1 ав 100 106 1:1,052,90 г 1 г 0 1:1 Зг 1 1 г 3,08 1 гЗ ЗассЬ.сегвч 1,в 1 авОкраска тиазиновым красным, инактивацияэтанолом 1:13:1 1 г 1,03293 г 10 1 гЗ 03 1 гЗ Измерения проводились на спвктрофг флуориметре Аш 1 псо Вогвпап.П р и м е р 1, К 1,8 мл суспенэии клеток Е. со 11 (8"часовая культура), содержащей живые и мертвые клетки, добавляют 0,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,0 " 7,8, через 3 мин готовят клеточный препарат по Виноградскому, считают число ярко флуоресцируюггих мертвых клеток, а оставшуюся суспен зию пр игревают 3 мин при 98 С, снова готовят клетоцййй препарат по Вино- градскому, считают общее количество флоуресцирукщих клеток и по разнице между двумя отсчетами находят число 15 живых клеток. Клетки в препаратах просчитывают на люминесцентном мйкроскопе при возбуждении сверху сине- фиолетовым светом (объектив х 90, окуляр к 10). 20П р и м е р 2. К 1,8 мл суспензии 24-часовой культуры ЗассЬ. сегвчАв 1 ав, содержащей различные соотношения жи= вых и мертвых (убитых спиртом) клетогг, добавляют 0,2 мл водного раствора мвтиленового синего (1 мг/мл) и проводят операции, как указано в при" мвре 1, за исключением того, что подсчет ведут на светопольном микроско,пе при освещении снизу и считают клетки, ярко окрашенные в синий свет,Соотношение живыегмертфвне.1018 И 0 Фиг,иг.4 Составитель В,Голимбетедактор О.Половка Техреду.Костик . Ко ор Л.Боква 3636/20Тирам 523 ВНИИПИ Государственног по делам изобретений 113035, Ж, РаушскаяПодписСССР камите открыт аб., д й4/5 ЮЮ ЙВВВаееаВВВФул,Проектная, 4 илиал ППП фПатеитф е,иго Такиьг образом, предлагаемый способпо сравнению с известинцев позволяетускорить определение с 26 ч до1-1,5 ч а такие снизить трудоемкость вза счет проведения простых операций, не требующих омывок реактивов и поз воляющих использовать один набор регистрирующей аппаратуры.