Способ определения осмотических свойств клеточных мембран

(511 4 С 01 Н 24/08 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(53) 539.143.43(088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(56) СопГоп Т., ОыгЬгей К. Иойег йИЕовьоп регшеаЬ 1.Г 1 у оГ егугЬгосугез азпи, а ппсГеаг шадпег 1 ре гезопапсе гесЬп 1.аде. - В 1 осМш, В 1 орЬув. Асса, 1972, ч. 288, р. 354-361.ЯшаГГ И.С., Со 11 зге 1 п .Х.Н. ТЬе еУГесй оГ оЬап 81.п 8 ехггасеГГпГаг озшоГаГ 1.гу оп агег ггапзрогг. 1 п гЬе Ьпшап ген Ь 1 оод сеГГаз шеазпгед Ьу гЬе сеГГ чагег гес 1 депсе г 1 ше апй гЬе асгЫаг.акоп епегяу оГ дагег ггапзрогй. - В 1.осЬдш., ВдорЬув. Асйа, 1981, ч. 640,р. 430-438. 801224693 А(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСМОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН (57) Изобретение относится к исследованию вещества методом ЯМР и может быть использовано для контроля осмотических свойств клеточных и везикулярных мембран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа. Сущность способа заключается в следующем, Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды образца суспенэии клеток в исходном состоянии, переводят клетки этого образца с сохра" нением их количества из исходного со-стояния в исследуемое, добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации и измеряют среднее время жизни молекул воды в1 й клетках и амплитуду сигнала ЯМР от е протонов внутриклеточной воды. Далее аналогичные операции проделывают для серии исследуемых образцов.122461Изобретение относится к физическим методам исследования вещества на основе явления ядерного магнитного резонанса и может быть использовано в микробиологической и пищевой5 промьгшленности, медицине, биологии и других областях естественных наук, где необходимо проводить быстрый и точный контроль осмотических свойств клеточных и везикулярных мембран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек.Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способаи сокращение времени анализа.Сущность способа заключается в следующем.Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды Мобразца суспензии клеток в исходном состоянии (при исходной осмоляльности внеклеточной среды) и одном выбранном значении температуры, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного состояния в исследуемое (к исследуемой осмоляльности внеклеточной среды), добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации Я 5 7 ммоль)и измеряют в этом состоянии при одном выбранном значении температуры среднее время жизни с молекул воды в клетках и амплитуду сигна.ла ЯМР от протонов внутриклеточной воды МДалее аналогичные операции проделывают для серии иэ исследуемых значений внеклеточной осмоляльности. Таким образом, в предлагаемом способе исключается операция измерения4 40 температурной зависимости ь при каждом значении исследуемой внеклеточной осмоляльности, что значительно сокращает затраты времени. Если количество клеток во всех исследуемых45 состояниях одинаковое, то отношение М./Г 1,= 1 для всех 1 = 0,1Б, где Й . и И - амплитуды сигналовь ьЯИР в одном из исследуемых и исходном состояниях образца, По измеренным значениям с и И , и И, и иэ 50 вестным формулам оценивают изменения внутриклеточного объема 7, образца и определяют диффузионную водную проницаемость (ДВП) клеточных мембран.Способ осуществляют следующим об 55 разом.Часть исходной суспензии клеток (объемом = 0,1 - 0,2 мл) помещают в 93 2ЯМР-ампулу, измеряют амплитуду И сигнала ЯМГ от протонов воды. Затем клетки образца переводят в одно из исследуемых состояний при добавлении парамагнитного вещества в таком количестве, чтобы его концентрация во внеклеточном растворе не превышала 5-7 ммоль. Измеряют по точкам кривую спада поперечной намагниченности М которую можно разложить на сумму1 трех экспонент с параметрами: ТсМ,Т,И иТс,Ис,гд М 11 - амгиштуды отдельных комнт соотвное Т, - короткое Т- промежу - точное время поперечной релаксации. Первая группа параметров (ТМ, ) относится к протонам внутриклеточных структур и мембран клетки, т,е.к твердому телу, поэтому Т значительно короче времени Т и Т каждая иэ двух остальных компонент характеризует протоны внутри- н внеклеточной воды.Дапее при том же исследуемом значении внеклеточной осмоляльности готовят образец для измерения в нем времени релаксации протонов внутриклеточной Т или внеклеточной Т7.оводы. Используя значения Т , ИЕа аф Т , М и Т нли Ти выражения для двухфазной системы ядерных спи - нов с обменом намагниченности между фазами, определяют одновременно среднее время жизни молекул воды в клетсках с и относительное количество (долю) внутриклеточной воды Р дляа каждого исследуемого состояния образца.Амплитуду Й сигнала ЯМР, соответствующую протонам внутриклеточной воды в исследуемом состоянии образца, определяют из соотношения И =. Р, (И + И). Далее проделывают такие же операции для каждого значения исследуемой внеклеточной осмоляльности. Исходное состояние образца принимают за контрольное.По измеренным значениям амплитуд сигналов и по известным формулам оценивают изменения внутриклеточного объема 7, исследуемых состояний, а затем определяют диффузионную водную проницаемость клеточных мембран по отношению к исходному состоянию образца.П р и м е р. Определение относительных значений количества внутриклеточной воды и диффузионной воднойпроницаемости эритроцитарных мембранот величины осмоляльности внеклеточной среды, создаваемой хлористымнатрием, при + 5 С.Кровь объемом по = 0,1 - 0,2 лразливают в две ПР-ампулы (1 и),измеряют ампл туду М л = 11,7 + 0,1сигнала поперечной намагниченностиМ, протонов воды в образце 1, Амплитуда сигнала ЯИР измерена в условных единицах, Затем к образцам 1и 1 добавляют по 3 мл водного раствора хлористого натрия, например,осмоляльностью П = 0,28 осм. В образец 1 добавляют дополнительно25 мкл водного раствора пСУ исгходной концентрации 0,5 моль с целью,чтобы его конечная концентрация быламенее 5 ммоль. Образцы выдерживаютв солевом растворе 30 мин. Затемэритроциты образца 1 осаждают =1 минпри 1600 я (М = 9,8 м/с ), супернатант отбирают в таком количестве,чтобы объем оставшейся суспензиибыл равен = 0,1 - 0,2 мл, Эритроциты образца 1 осаждают 40 мин при1600 я, супернатант полностью отбирают,Методом Карра-Парселла-Мейбумаилла (КПМГ) измеряют время спинспиновой релаксации Т = 76,9 + 2 мспротонов внутриклеточной воды в плотноосажденных эритроцитах образца 1и тем же методом - параметры кривойМ (Т = 24,1 + 0,5 мс, М= 3,57++ 0,03, ТМ = 2,44 + 0,06 мс, ИМ =6,28 + 0,06, Т ,= 0,43 + 0,01 мс,М = 0,91 + 0,0) "успензии эритроцитов образца 1. Соответствующая протонам гемоглобина и мембран компонен 1та (Т , И ) спада И в расчетах неучитывается.На основе паРаметРов Тг, ТгМ, И ,М, Т вычисляют одновременно средгаМнее время жизни молекул водывклетке и долю внутриклеточной воды Рв суспензии клеток образца 1. Эти величины равны 1. = 33,8 + 0,8 мс, Р= 0,313 + 0,005, Находят амплитудупротонов внутриклеточной воды М == Р (М + 1.) = 3,08 + 0,05. Такимже образом определяют аналогичныепараметры образцов с разным осмоти;ческим давлением внеклеточной средыи по известным формулам - относительные величины количества внутриклеточной воды и ДВП эритроцитарных мембран в 1-м исследуемом состоянии образца относительно его исходного состояния, за которое принята осмоляльпость П = 0,28 осм внеклеточного раствора хлористого натрия, близкая к изотонической осмоляльности плазмы крови. Изменение коли чества внутриклеточной воды в эритроцитах в координатах Вант-Гоффа (Ч1-П ) описывается линейной зависимостьюс коэффициентом наклона К = 0,246,Таким образом, в исследуемой области осмоляльностей эритроцитарнаямембрана проявляет идеально упругиесвойства, т.е. ведет себя как идеальный осмометр. ДВП эритроцитарноймембраны остается постоянной вблизииэотонической точки и возрастает сувеличением и уменьшением осмоляльности внеклеточной среды. Следовательно, энергетический барьер для 25 трансляционной диффузии молекул воды через эритроцитарную мембрануминимален вблизи изотонической осмоляльности.Формула изобретенияСпособ определения осмотическихсвойств клеточных мембран, включающийизмерение среднего временижизнимолекул воды в клетКах образца методом ядерного магнитного резонанса(ЯР) с добавлением во внеклеточныйобъем образца парамагнитного вещества низкой концентрации, о т л и ч а ю щ и й с я тем что с целью расширения функ-иональных воэможностейи сокращения времени анализа, измеряют отношения началъных амплитучсигналов ЯИР от протонов внутриклеточной воды образца в исходном иисследуемых состояниях, получаемыхпри добавлении нескольких порцийпарамагнитного вещества, по измеренным отношениям судят об измененияхвнутриклеточного объема Ч исследуел,мых состояний и по значениямиЧ определяют диффузионную воднуюпроницаемость клеточных мембранно отношению к исходному состояниюобразца