Способ определения резистентности эритроцитов

(21) (22) (46) (71) нов ред. с. 8 (54) ТИ Э Изобр медицины а именно зовано как кой работе ение относится кв частности к гемлабораторным спо степени поврежденови, и может быть ласт тологииобам ри тоян ческого со эритроцито тике в кач явления эрит- спопь тастве тов ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 4213846/28-1420. 03, 8730.03.89. Бюл. У 12Институт фотобиологии АН БССР нская областная больница-. Е.И.Слобожанина, В,В.СавостьяН.М,Козлова н Е.А.Черницкий 616,07 (088.8)Справочник по клиническим латорным методам исследования/ Под Е.А,Кост. М.: Медицина, 1975, 8.СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЧ РЕЗИСТЕНТНОС- РИТРОЦИТОВ(57) Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии, к лабораторным способам выявления степениповреждения эритроцитов крови, предназначено для изучения физико-химического состояния консервированныхэритроцитов и для клинической практики в лабораторных методах оценкисостояния мембран эритроцитов при различной патологии системы крови. Цельизобретения - ускорение и.повышение тоточности способа. Для этого к пробекрови, стабилизированной гепариномиди цитратом натрия, добавляют изотонический р-р ЫаС 1, центрифугируютпри 3000 я 5 мин. К отдельному осадку эритроцитов добавляют иэотоничесЯО 146946 кий р-р ИаС 1 (разведение в 100-150 ;раз), делят суспенэию на 2 равнь.е части, контрольную и опытную, Контрольная проба используется для получения гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавления в суспенэию 2%-го р-ра тритона Х, Опытную пробу получают путем добавления к суспензии эритроцитов изотонического р-ра ИаС 1 аналогично контрольной пробе, прог.:евают 10 ф 1 мин при 48-50 С, После температурной инкубации суспензию эрнтроцнтов центрнфугируют 5 мин при 30008 собирают супернатанты, регистрируют величину их оптической плотности при В =: = 540 нм. Так как в пробирку с контролем добавлен цетергент тритон Х, все эритроциты гемолизировались и величину оптической плотности этого образца принимают соответствующей 100%-ному гемолизу (Д 100%), 1Исходя из этого, подсчитывают % гемолиэа при 48-50 С по формуле: % гемолиза = (08 5, 100)Ф соо; где Р. - величина оптической плотности опытной пробы; 100 - величина разведения проб. При величине гемолиэа 5-9% определяют умеренное снижение резистентностн, при гемолиэе более 10% - выраженная степень снижения резистентности эритроцитов. 2чно-исследователь сзучении физико-химия консервированных и клинической праклабораторного метода, з1469 позволяющего оценивать мембран эритроцитов при различнойпатологии системы крови, а также адекватность гемотрансфузиойной терапии.Целью изобретения является уско"5 рение и повышение точности способа.Способ осуществляется следующим образом.Берут 0,2-0,4 мл свежей крови, стабилизированной гепарином, либо цитратом натрия. К ней добавляют 20- 40 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают и затем центрифугируют при 30008 в течение 15 5 мин. Супернатант сливают, а к полученному осадку эритроцитов добавляют 9-12 мл изотонического раствора ИаС 1 (разведение в 100-150 раз) и делят суспензию эритроцитов на 2 20 равные части: 1 (контрольная проба) используется для получения полностью гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавления в суспенэию О, 1 мл 2%-ного раствора тритона 25 Х. Суспензия стоит 10+1 мин при, комнатной температуре; 2 (опытная проба) - к суспензии эритроцитов добавляется 0,1 мл изотонического раствора хлористого натрия, чтобы разведение эритроцитов было, как в пробирке 1, и прогревают суспензию в течение 10+1 мин при 4850"С, После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифугируют 5 мин при 3000 я и собирают супернатанты. Затем регистрируют величину оптической плотности супернатантов при длине волны 540,нм. Так как в пробирку В 1 бып добавлен детергент тритон Х, вследствие чего все эритроциты гемолизировались, то величину оптической плотности, полученную для это-. го образца, можно принять соответствующей 100%-ному гемолизу. Исходя из этого подсчитывают процент гемолиза при 48-50 С по формуле. Э фв-ботас 100Процент гемолиза--Фоофгде Э. .- величина оптической плот ности опытной пробы;Э,., - величина оптической плотности контрольной пробы;После этого судят о резистентнос 55 ти эритроцитов, причем при величине гемолиза 5-9% определяют умеренное снижение резистентностн, а при величине гемолиза более 10% - выражен. ную степень снижения резистентностиэритроцитов.Проведенными экспериментами установлено, что степень гемолиза эритроцитов, полученных иэ крови здоровыхдоноров, при исследовании предлагаемым способом не превышает 2-4%, а индивидуальные значения этого показателя колеблются от 0,2 до 4%.П р и м е р 1. В процессе диспансерного наблюдения за больным Мстрадающим врожденной микросфероци-,тарной анемией, проводили исследова"ние степени повреждения эритроцитовкрови. Для анализа брали 0,2 мл крови, стабилизированной цитратом натрия, к ним добавляли 20 мл изотонического раствора ИаС 1, содержимоеперемешивали и затем центрифугировали 5 мин при 3000 я. Супернатант сливали, а к осадку эритроцитов добавляли 9 мл изотонического раствораИаС 1 (разведение в 100 раз), делилиполученную суспензию на 2 части. Кодной части добавляли О, 1 мл 1%-ногораствора тритона Х(100%-ный гемолиз эритроцитов) и оставляли еепри комнатной температуре. К другойчасти добавляли 0 1 мл изотанического раствора ИаС 1 и помещали ее втермастат, где й = 48 С. Выдерживали в течение 10 мин. Затем обе пробирки центрифугировали при 30008 втечение 5 мин. Супернатанты отбиралии на спектрофотомоторе регистрировали величину оптической плотностипри длине волны 540 нм в пробирках1 и 2 и по Формуле определяли процентгемолиза. В данном случае исследование крови больного показало, что гемолиз эритроцитов составляет 27%,что указывало на выраженное снижение резистентности эритроцитов, аповторное исследование крови черездва месяца после проведенного лечения показало, что гемолиз равен5,2%, что указывало на увеличение,резистентности эритроцитов в кровибольного и позволило считать патологический процесс стабилизировавшимся. Исследование крови по прототипупоказало лишь визуально, что в обоихслучаях сыворотка крови приобрелакрасноватый цвет, что свидетельствовало лишь о наличии гемолиза, но неоценивало количество его в сыворотке, т.е, не оценивало степень повреждения клеток, 5 146964 6П р и м е р 2Больной Б стра- тельного общего состояния и отсутдает хронической гипопластической ствия анемического синдрома, В проанемией с гемолитическим компонентом цессе динамического дисперсного набв течение 6 лет. У больного отмечают- люцения за больным простое нетрудоемся выраженные посттрансфузионные реак-кое исследование резистентности5цни гемолитического и негемолитичес- эритроцитов дало следующие результакого типа. Многократно при каждом ты: исследование, проведенное при поступлении в стационар определялась поступлении, - 277 гемолиза, а исосмотическая резистивность эритроци следование через 1,5 мес. - 9,07. гетов, которая всегда оказывалась молиза, что указывало на увеличение сниженной, независимо от клиническо- резистентности эритроцитов в крови го состояния больного, от активности больного и позволило считать патотрансфузионной терапии, логический процесс стабилизировавшимНа фоне проводимого лечения - в 1 б ся.первую очередь трнсфузий отмытых Предлагаемый способ позволяет размороженных зритроцнтов, у больного быстро и точно оценить степень повнаступило ухудшение клинического сос- реждения эритроцитов в крови больнотояния, связанное с посттрансфузион- го и определить тактику лечения больными реакциями, что было четко под ного. При исследовании крови гематверждено исследованием; степени пов- тологических больных предлагаемым реждения эритроцитов предлагаемым способом (при соблюдении режима, укаспособом. Для анализа брали 0,2 мл занного в Формуле) наблюдалась умекрови, стабилизированной цитратом ренная или выраженная степень повнатрия, к ним добавляли 20 мл изото Б режедния эритроцитов. Лишь в одном нического раствора ИаС 1, содержимое случае при железодефицитной анемии перемешивали и затем центрифугирова- (заболевание, при котором мембрана ли в течение 5 мин при 3000 я, Супер- эритроцитов обычно не повреждается) натант сливали, а к осадку эритроци- степень гемолиза эритроцитов была в тов добавляли 10 мл изотонического ЗО пределах нормы (0,83 Х). В то же врераствора ИаС 1 (разведение в 150 раз), мя исследование крови здоровых .людей делили полученную суспензию на 2 час- показало, что процент гемолиза эрити. К одной части добавляли 0,1 мл троцитов не превышает 47. во всех слу-ного раствора тритона Хи ос- чаях.тавляли при комнатной температуре, Таким образом, предлагаемьй сло- К друго" части добавляли 0,1 мл иэо- соб надежен, прост в исполнении, на тонического раствора МаС 1 и помеща- осуществление его достаточно 40 мин.оли ее термостат, где при= 50 С По сравнению с прототипом для осувыдерживали 11 мин, затем обе про- ществления предлагаемого способа бирки центрифугировали при 3000 я в40времени требуется в 10-15 раз мень- течение 5 мин. Супернатанты исследо- ше, количество образца взятого для вали при длине волны 540 нм и рассчи- анализа тоже сокращается примерно тывали процент гемолиза эритроцитов, в 20 раз, кроме этого предлагаемый Степень,гемолиза эритроцитов до способ дает количественную оценку трансфузии составляла 5 Ж, а после устойчивости эритроцитов, трансфузии - 133, т.е. до трансфузии45Использование предлагаемого спосоу больного наблюдалась умеренная сте- ба в гематологии обеспечит прогнозипень повреждения эритроцитов после рование развития тяжелых осложнений трансфузии - степень повреждения ста-, при заболеваниях крови. Способ также ла выраженной. Стоит отметить, что может быть использован при апробации эти показатели определены на фоне50новых лекарств и при научных исслезначительной билирубинемии и выра- дованиях. Способ доступен любой научженного ретикулоцитоза, сохранявшихся ной и клинической лаборатории. на протяжении всего курса лечения. Способ позволяет определить такП р и м е р .3. Больной И., стра- тику ведения больного (количество дает врожденной микроцитарной гемо-и вид трансфузионной терапии: эритролитической анемией. у больного посто- цитарная масса, отмытые размороженные янная билирубинемия, выраженный рети" эритроциты), конкретизировать примекулоцитоз на фоне вполне удовлетвори- нение различных других лечебных1469464 Составитель Л АклинаТехред М,Дидык Корректор М.Максимишинец,. Редактор К.КрупкинаВи иФЗаказ 1355/52 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР .113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 мероприятий. Результаты исследования,полученные данным способом, наряду с.другими показателями помогут врачулучше оценить клиническое состояниебольного, что немаловажно, например, для оценки трудоспособностибольного,Формула из.обретенияСпособ определения реэистентности 10эритроцитов путем их нагревания,отличающийся тем, чтос целью ускорения и повышения точности способа, получают суспензиюотмытых эритроцитов, разводят в 15100-150 раз изотоническим раствором хлористого натрия с последующим проведением нагревания. одной части сме-.си 48-50 С в течение 10+1 мин и одновременной обработкой другой частисмеси 1-2 Х-ным раствором тритонаХ, затем полученные образцыцентрифугируют, регистрируют их оптическую плотность при длине волны540 нм, рассчитывают процент гемолизированных эритроцитов и при еговеличине 5-9 Х определяют умеренноеснижение резистентности.эритроцитов,а при величине более 103 - выраженное снижение резистивности эритроцитов.