Способ определения плазминогена в эуглобулиновой фракции крови

(57) Из обре логии. Цель специфпчнос кий и опогичотражающекалибровосодержа ни1 табл. ИЯ ПЛАЗМИНОГЕНЦИИ КРОВИ СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный карднаучный центр,ТпгоЫ., Наевозгаа,1275, 1979,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛ В ЭУГЛОБУЛИНОВОЙ ФР ювету спек вор фибрино фракцию пла добавляют т ный альбуми добавления нение свето деляют танг тение относитсяизобретения - ити и точности сптрофотометра вно р гена и зуглобулиновую змы крови, инкубируют и ромбин, бычий сывороточн и стрептокиназу. После смеси регистрируют измепропускания. Затем опреенс угла наклона кривой, процесс лизиса фибрина. П ому граФику рассчитывают плазминогена в пробе.3 ил- На Фиг. 1 показан график изменения светопропусания при 500 нм впроцессе образования и последующеголизиса Фибринового сгустка (где слева направо представлены кривые ходареакции, полученные лри добавлении50, 40, 30, 20 и 10 мкл эуглобулиновой Фракции стандартной плазмы, скорость лизиса Фибрина ЬТЖ/ мин)определяли по тангенсу угла наклонапрямолинейного участка), на Фиг. 2 калибровочный график для определениясодержания плазминогена по скорости 20лизиса Фибрина (зависимость описывается уравнением У = -3,28+0,32 Х, гдеГ = 0,99), на фиг. 3 - график сравнения результатов определения содержания плазминогена амидолитическим25(ось орцииат) и предлагаемым (осьабсцисса) методами (зависимость опи-сываетея уравнением 7 = 22,б 8 ФО,76 ХГ 2 = 0,91),Способ осуществляют следующим образом.Из цитратной плазмы осаждают эуглобулиновую Фракцию, Затем вносят ее всовету спектрофотометра, содержащуюстандартный раствор Фибриногена свободного от нлазминогена, Реакцию за",пускают дабащтением смеси тромбинасо стрептокиназой, стабилизированнойбычьим сывораточным альбумином, ирегистрируют изменения светопропускания нри 5 ОО нм, происходящее при образовании и последующем лизисе Фибринового сгустка, Скорость лизиса, определяемая по линейному участку кривой, отражающей процесс лизиса сгуст ка, .прямо пропорциональна количеству,плазминогена в пробе (Фиг, 1). Опреде.лив скорость лизиса, находят соответ"ствующее значение содержания плазмнньгена по калибровочному графику, построенному с использованием зуглобулиновой фракции стандартной плазмы.В предлагаемом способе количествоплазминогена определяетсй по активности образующегося плазмина, а не комплекса стрептокиназа - плазминоген.,Оптимальное количество стрептокиназы,необходимое для активации плазминогена в предлагаемом методе, находится в пределах 15-25 Е на 0,05 мл эуглобулиновой Фракции. При добавле" нии больших количеств стрептокиназы скорость лизиса фибрина уменьшается. График зависимости скорости лизиса от количества добавленной эуглобулиновой фракции стандартной плазмы (Фиг. 2) пересекается с осью абсцисс в точке, соответствующей 5 мкл эуглобулиновой фракции стандартной плазмы. Из этого следует. +го при, добавлении 20 Б стрептокиназы 103 лазминогена стандартной плазмы уходит на образование активаторного комплекса. При добавлении избытка стрептокиназы боль шее количество стрептокиназы уходит на образование активаторного комплекса и, соответственно, меньшее количество превращается в плазмин, Скорость лизиса уменьшается. Использование меньших количеств стрел оиназы нежелательно, так как в крови обычно присутствуют антитела к белкам стрептококков, которые могут нейтрализовать некоторое количество стрелктокиназы.Для выполнения первого определе-. ния требуется 1 ч 30 мин на получение эуглобулиновой Фракции и 10-30 мин на постановку реакгпи. Время протека ния реакции зависит от содержания плазминогена в пробе, При 1003 реакция завершается за 5 мин, а при содержании плазггиногена 20 Е требуется около 20 мин, Образцы плазмы можно,охранить при -20 С в течение месяца. Эуглобулиновые фракцйи хранили при 4 С и использовали в течение суток. оП р и гл е р 1, К 4 мл дистиллированной воды добавили 75 мкл 1 Е-йой уксусной кислоты и 0,25 мл исследуе" мой плазмы. После инкубации в течение 20 мин при 4 С центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Осадок раот,ворили в 0,25 мл боратно-солевого раствора (13,5 мИ 11 аВ 010 Н О, 145 мМ ЯаС 1) . В кювету спектрофотометра внесли 400 мкл раствора фибри,ногена, растворенного в концентрации 1,5 мг/мл в 0,15 М Трис-НС 1 буфере рН 7,2 и 50 мкл эуглобулггновой Фракции плазмы. Инкубировали 5 мин при 37 С, затем добавляли 50 мкл смеси, содержащей на 1 мл 1,5 мг тромбина (Каунасс), 5 мг бычьего сывороточного альбумина (Зг.рпа и 400 Е стрептокиназы (Са 1 Ьхос 1 гецд, приготовленной на 0,15 М Трис-НСУ буфере, рН 7,.2. Через 30 с после добавления смесиСпособ определения плазминогенав эуглобулиновой фракции крови, вклю чающий активацию его стрептокиназой,добавление в пробу лизируемого субстрата с последующей регистрациейскорости лизиса по изменению светопропускания и расчетом по калибровочно му граФику, о г л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения специфичности и точности способа, в качествесубстрата используют избыток Фибрина,а стрептокиназу добавляют в количе стве, обеспечивающем выход кривой лнзиса на линейный участок с изменения- ми не менее 2,5% светопропускания вминуту. Сдособе 0,524,50 7,58 4,57 6,58 3,54 6,52 4,54 0,58 2,55 713,2 Предяага 9,1 38,0 41,4 44,1 37,6 45,7 44,5 43,2 . 41, 713, 1 Иввествый 44,917,3 56,8 58, 7 3 143 б 0 включали регистрацию изменений светопропускания.После завершения реакции определяли тангенс угла наклона кривой, от 5 ражающей процесс лизиса Фибрина. Содержание плазминогена в пробе определяли по калибровочному графику (фиг. 2). При низком содержании плазминогена в пробе ( с 20%) для повыше ния точности определения целесообразно использовать 100 мкл эуглобулиновой фракции и 350 мкл раствора фибриногена, а содержание плазминогена, определенное из графика (Фиг. 2), 15 разделить на 2.На Фиг. 3 представлены данные 30 определений содержания плазгжногена, выполненных по известному способу с использованием фромогенного субст4рата Вег 1 сйготп Р 1 фирмы ВеЬгпреге (ордината) и по предлагаемому спосо- бу (абсцисса). Использовали кровь доноров и больных, не страдающих тромбозами (содержание плазминогена 25 3 75%) и кровь больных после лечения стрептокиназой (плазминоген70%) . Применение метода линейной регрессии для анализа данных показало, что зависимость между величинами, получен ными этими двумя способами, описывается уравнением прямой У = 0,7 бХ + + 22,б 8, коэффициент корреляции г= = 0,91. Пересечение прямой с осью ординат в точке, соответствующей .22,б 8, хорошо согласуется с данными о завышении истинного содержания плазминогена при определении его по амидолитической активности при некоторых патологиях. Разница в 10-20% становится особенно выраженной при низкой концентрации плазминогена, обусловленной потреблением этого белка в ходе Фибринолитической терапии. Кроме того, повышенная концентрация продуктов деградации фибриногена, как результат активации Фибринолиза, создает еще один источник ошибок при 734использовании известного способа в этом случае (таблица) .С целью сравнения точности был приготовлен раствор плазминогена с концентрацией белка 0,1 мг/мл и проведено 10 параллельных определений по предлагаемому и известному способам. Причем в двух последних определениях к реакционной смеси добавили Фибриноген до конечной концентрации 1 мг/мл. Этим моделируют одно из патологических состояний, когда известный способ дает завышенные величины.Из данных таблицы следует точность предлагаемого и известного способов примерно одинакова при параллельных измерениях сдного и того же образца. Но амидолитическая активность комплекса стрептокиназа-плазминоген существенно потенциируется Фибриногеном (пробы 9 и 10), что приводит к появлению систематической ошибки в определении по известному способу.Если сравнивать данные всех 10-ти определений, можно говорить о повышении точности при использовании предлагаемого способа, которое обусловлено устранением систематической ошибки,Формула и,зобретения436073 75 100 ау оставитель А Агур едактор А.Шандор аказ 5643 4 ираж 84 одписное ВНИИПИ Государственного комитета ССС по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,л. Проектна зводственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгор