Способ консервации периферического нерва

(51) 4 А 01 М ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЬСТВУ 6/28-1485 21) 39927 22) 17.12 46) 23.05 71) Киевс ут усовер кий инс ания кров Яценко, периферинного в чеусл ратуры,ации.ауке ИфЕРИЧЕС. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИ 8. Бюл. У 19й государственный инстинствования врачей и Ки ский научно-исследовательтут гематологии и перелив(56) Яценко В.П. Состояниского нерва, консервироовиях очень низкой те)йи результаты его транспланАвтореф. дисс. канд. мед.Киев, 1968,(54) СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ПЕКОГО НЕРВА(57) Изобретение может быть использовано в нейрохирургии, Цель изобретения - повышение жизнеспособностипрепарата. Производят инъекцию сосудов нерва раствором, содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин и физраствор, Затем помещают препарат в защитную среду сглицерином, сывороткой крови, глюкозой, гидрокортизоном, инсулином исредой 199. Нервы переносят в контейнер, заполненный средой того же сос-.тава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот. Использование таких аллонейтротрансплантатов позволитвосстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, иннервируемой поврежденным нервом, 1 39014Изобретение относится к области медицины и касается конервации тканей.Цель изобретения - повышение жиз 5 неспособности препарата.Способ осуществляют следующим обр азом.При строгом соблюдении правил асептики и антисептики осуществляют доступ к артерии, ветви которой кровоснабжают нервные стволы, подлежащие подготовке к аллотрансплантации. В стенке артерии делают небольшой надрез, через который в ее просвет 15 вводят иглу, соединенную с аппаратом для инъекции жидкостей. Делают надрез стенки лежащей рядом вены. Производят инъекцию выделенной артерии раствором, содержащим, г/л: 20Диметилсульфоксид 80-120Глюкоза 45-50Гидрокортизон 0,05-0,07Инсулин 50-70 ЕДФизиологический 25раствор До 100) млЭтот раствор должен быть охлажден до +4 С. Инъекцию проводят медленно, в течение 10-15 мин, давление во время инъекции, контролируемое маномет ром, не должно превышать 120 мм рт.ст, Инъекцию заканчивают при вытекании иэ разреза в вене криозащитной среды беэ примеси крови.После окончания инъекции артеРия и вена дистальнее кончика иглы перевязываются, иглу аппарата извлекают иэ просвета артерии. Время экспозиции раствора в сосудах, нерва составляет 30 мин. 40С соблюдением асептики и антисептики иссекают инъецированные нервы в течение 10-15 мин и переносят их в криозищитную среду содержащую, г/л:Глицерин 12 ООСыворотка крови 150-200Глюкоза 45-50Гидрокортизон О,05-0,07Инсулин 50-70 ЕДСреда 199 До 1000 млИнкубацию в данной среде продоло жают в течение 60-80 мин, при +4 С, после чего нервные стволы переносят в упаковку, заполненную криозащитной средой этого же состава, которую герметизируют и помещают в жидкийоазот при -196 С.Оценку жизнеспособности нервных стволов производят общеизвестными ме. тодами (трансплантация в дефект одноименного аллонерва, трансплантация в межмышечный дефект, культивирование 1 п ч 1 Сго, люминесцентная микроскопия, импрегнационные методики, изучение расщипанного нерва в фазовом контрасте и др. (после их быстрого отогревания в водяной бане при +42 С и отмывания криозащитной среды в растворе Хенкса в течение 30 мин).Проверку аллотрансплантатов и применяемых для их обработки растворов на стерильность производят согласно инструкции по бактериологическому контролю консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов.П р и м е р 1. Четырех собак массой 12-15 кг умерщвляют при помощи внутривенного введения гексенала. Через 3 ч после гибели животных с помощью аппарата Боброва производят инъекцию задних конечностей через брюшную аорту охлажденной до ,+4 С средой, содержащей 100 г диметилсульфоксида, 47,5 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.Через 30 мин иссекают седалищные нервы и инкубируют их в течение 70 мин в охлажденной до +4 С среде, содержащей 150 г глицерина, 175 г сыворотки крови (собачьей), 47,5 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл.Нервы переносят в контейнер, заполненный средой того же состава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот при -196 С.Через 4 мес, хранения нервы разо мораживают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и их отрезки длиной 6 см трансплантируют в дефект седалищных нервов восьми экспериментальных собак. Через 1-3 мес. после операции собак-реципиентов забивают и оценивают . жизнеспособность трансплантатов.Результаты исследования сравнивают с результатами, полученными при использовании в качестве трансплантатов нервов, подготовленных к аллотрансплантации по известному методу.Проведенные исследования показали, чтс аллонейротрансплантаты сохраняют жизнеспособность подавляющего большинства соединительнотканных иневральных клеточных элг ментов. Нейролеммоциты трансплантированных нервов размножаются не только в периферических, но и в центральных пучках аллотрансплантата. Разрушениепредсуществующих нервных волоконпо типу валлеровской дегенерациипроисходит по всей толще консервированного нерва с образованием типич"ных овоидов,Консервированный нервный стволслужит активным проводником регенерирующих нервных волокон из центрального отрезка нерва реципиента в периферический, Новообразованные осевые цилиндры уже к концу первого месяца после операции прорастают черезтолщу трансплантата и в большом количестве проникают в периферическийотрезок поврежденного нерва.Количество сохранивших свою жизнеспособность нейролеммоцитов составило 71":1,47.Проведено сравнение иммуногенности периферических нервов, подготовленных к аллотрансплантации по предлагаемому и известному способам. Изучены реакции регионарных лимфатических узлов и селезенки. Выяснено -максимальное число бластов и наибольшаяплотность малых лимфоцитов впаракортикальггых зонах лимфатическихузлов отмечены через 1-2 мес чослеоперации, что позволяет трансплантату нерва длительное время служитьпроводником регенерирующих аксоновиз центрального отрезка поврежденного нерва в периферический.П р и м е р 2. В опыт берутшесть собак массой 10-12 кг. Передние конечности двух животных через2 ч после эутаназии инъецируют охлажденным до +4 С стерильным раствоором, содержащим 80 г диметилсульфоксида, 45 г глюкозы, 0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.Через 30 мин, соблюдая правилаасептики и антисептики, в областипредплечий иссекают локтевые и срединные нервы и инкубируют их в течение 60 мин в охлажденной до +4 Ссреде, содержащей 120 г глицерина,150 г сыворотки кроьи, 45 г глюкозы,0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина среды 199 до 1000 мл,Нервы пеоеносят в контейнер сосредой этого же состава, который510 тизируют и переносят в жидкий азотпри в 1 С.Через 4 недели хранения образцыс нейротрансплантатами отогреваютв водяной бане при +42 С в течение30 мин, отмывают в растворе Хенкса и 50отрезки нервов длиной 6 см трансплантируют в дефекты одноименных:нервов четырех собак в реципиент,Последних умерщвляют через 1 мес, и оценивают состояние нейротрансплантатов.Процессы вторичной дегенерации иневротизации трансплантатов происходят равномерно по всей их толще,Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 73+1,17. 15 20 30 35 40 герметизируют и помещают в жидкийазот при в 1 С.Через 4 недели хранения нервыо отогревают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и их отрезки длиной 4 см трансплантируют в экспериментально создаваемые дефекты одноименных нервов четырех собак-реципиентов. Через 1 мес. собак-реципиентов забивают и оценивают состояние нейротрансплантатов.Пропессы валлеровской дегенерации пооисходят по периферии и в толше трансплантатов, Последние хорошореваскулярпзованы, причем новообразованные капилляры проникают в глубоко расположенные пучкиРегенирурующие осевые цилиндры невротизируютбюнгнеровские ленты трансплантатов,расположенные как в периферических,так и в центральных фасцискулах.Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 71+0,97.,П р и м е р 3. В опыт берутшесть собак массой 14-15 кг. Задниеконечности двух животных через 4 чпосле эутаназии инъецируют охлажденным до +4 С стерильным раствором,осодержащим 120 г диметилсульфоксида,50 г глюкозы, 0,07 г гидрокортизона,70 ЕД инсулина, физиологическогораствора до 1000 мл. Через 30 миниссекают мало- и большеберцовые нервы и инкубируют их в течение 80 минв стерильной охлажденной до +4 Ссреде, содержащей 180 г глицерина,200 г сыворотки крови, 50 г глюкозы,0,07 г гидрокортизона, 70 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в контейнер, заполненный средой этого же состава, который герме 1397014П р и м е р 4. Двух собак умерщвляют при помощи внутрив нного введения гексенала. Через 4 ч после смерти с соблюдением правил асептики и антисептики производят инъекцию их передних конечностей раствором, содержащим 125 г диметилсульфоксида, 50 г глюкозы, 0,08 г гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл. Через 35 мин иссекают срединные нервы и инкубируют их в течение 85 мин в стерильной охлажденной до +4 ОС среде, содержащей 185 г глицерина, 205 г сыворотки крови, 50 г глюкозы 0,08 г гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в упаковку, заполненную средой этого же состава, которую гер метизируют и помещают в жидкий азот (-196 С).Через 6 недель хранения аллонейротрансплантаты размораживают в водяной бане (+42 С), отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и трансплантируют в экспериментально созданные дефекты длиной 4 см одноименных нервов четырех собак-реципиентов. Последних умерщвляют через 1 мес. после операции и оценивают жизнеспособность трансплантатов.Процессы вторичной дегенерации и невротизации трансплантатов происходят равномерно, по, всей их толще. Количество жизнеспособных нейролем 35 моцитов составило 73+1,97.Установлено, что подготовленные по предлагаемому способу аллонейротрансплантаты могут храниться в сба лансированном солевом растворе в течение 2 ч после размораживания без существенного снижения жизнеспособности их клеточных элементов. Этого времени достаточно для подготовки 45 концов поврежденного нерва к анастомозированию с трансплантатом.Пример 5, Донор Р, 35 лет. Смерть наступила в результате ишемической болезни сердца. Через 8 ч 40 мин произведена инъекция сосудов50 правой верхней конечности стерильным раствором, охлажденным до +4 ОС и содержащим 100 г диметилсульфоксида, 50 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл. Через 30 мин после окончания инъекции с соблюдением асептики и антисептики произведено иссечение в области предплечья отрезков срединного и локтевого нервов длиной 15 см. Последние помещены на 70 мин в охлажденную до 4 С среду, содержащую 150 г глицерина, 150 г сыворотки крови, 50 г глюкозы, 0,06. г гидрокортизона 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Аллонейротрансплантаты перенесены в упаковки, заполненные средой этого же состава, которые герметизированы и помещены в жидкий азот при в 1 С.Через 11 мес. упаковка, содержащая срединный нерв, была разморожена в водяной бане при +42 С, аллонейротрансплантат отмыт в растворе Хснкса в течение 30 мин и использован для нейропластики дефекта одноименного нерва у больного Л, 25.лет, поступившего в клинику с диагнозом травма ножом в верхней трети правого предплечья, полный перерыв срединного нерва.На операции был эамещен травматический дефект срединного нерва консервированным по предлагаемому способу трансплантатом одноименного нерва длиной 5 см.Контрольный осмотр через 1 год после проведения операции выявил восстановление чувствительности в зоне, иннервируемой срединным нервом, до степени Б , восстановление функции мышц передней поверхности предплечья до степени М, мышц кисти - до степени М . По данным элект 3ромиографии электрическая активность мышц правого предплечья и кисти достоверно не отличалась от таковой на здоровой конечности. При пробе Минора отмечено полное восстановление потоотделения на пальцах и ладони в области,иннервируемой срединным нервом, что свидетельствует об успешной регенерации срединного нерва. Подготволенные по предлагаемому способу аллонейротрансплантаты были использованы для пластики 6 срединных и 3 локтевых нервов у 8 больных, Величина дефектов нервных стволов составила 5-7 см (у пяти больных) и 10-20 см (у трех больных). Изучение отдаленных результатов операций показано, что положительный результат получен у шести больных. Два неудовлетворгельных результата не связаны с применением предложенного спосо1397014 Формула изобретения Способ консервации периферического нерва путем помещения в защитную среду, содержащую глицерин, сыворотку крови и среду 199 с последующим замораживанием, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности препарата, перед помещением в защитную среду производят инъекцию сосудов нерва раствором,Составитель Е.ЯрныхТехред Л.Олийнык Корректор А. Тяско Редактор Е. Папп Заказ 2543/3 Тираж 455 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета .СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 ба, а я вили сь следствием чр езмер но больших дефектов (более 12 см) и грубого рубцового перерождения окружающих тканей до операции.Использование изобретения позво. лит восстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, инервируемой поврежденным нервом. содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин, физраст,вор при следующем количественномсоотношении компонентов, г/л: 5Диметилсульфоксид 80-120Глюкоз а 45-50Гидрокортизон 0,05-0,07Инсулин 50-70 ЕДФизраствор До 1000 мл,а затем помещают препарат в защитную среду, дополнительно содержащуюглюкозу, гидрокортизон, инсулин приследующем количественном соотношениипненв, г/л:Глицерин 120-180Сыворотка крови 150-200Глюкоза 45-50Гидрокортизон 0,05-0,07 20 Инсулин 50-70 ЕДСреда 199 До 1000 мл