Способ количественного определения адениновых нуклеотидов

7027 А 1 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 504 С ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМ ВИДЕТЕПЬСТВУ 54) СПОСОБ КОЛИЧЕЛЕНИЯ АДЕНИНОВЫХ Н 57) Изобретение о иохимического ана етения является с ТВЕННОГО ОПКЛЕОТИДОВносится к областиза. Целью изобижение предела РЕДЕ с ф Феей ССУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(56) Авторское свидетельство ССВ 987976, кл. С 12 И 9/02, 1981Авторское свидетельство СССРР 1045668, кл. С 12 ч 1/66, 198 обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращение расхода ферментов. Способ осуществляется с помощью соиммобилизов анной системы люциферазы, аденилаткиназы и пируваткиназы. В качестве источника люциферазы и аденилаткиназы используют неочищенные лампочки светляков 1.исо 1 а пппяге 1 са, Массовое соотношение лампочек светляковпируваткиназа ; бромциансефароза составляет 50:(3-12):(50-100), Способ позволяет снизить расход дорогостоящих высокоочищенных ферментов и повысить чувствительность определения. Способ может найти применение в медицине пищевой промьппленности и в научных исследованиях,(2) АТФ+пируват 40 45 50 55 1 131Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения адениновых нуклеотидов:(аденозин-монофосфата (АМФ), аденозин-дифосфата (АДФ) и аденозин- -5 -трифосфата (АТФ).Цель изобретения - снижение предела обнаружения, а также сокращениерасхода ферментов при определении адениновых нуклеотидов.Способ заключается в следующем,В качестве источника люциферазы и аденилаткиназы используют содержащий оба фермента экстракт лампочек светляков 1.цсо 1 а шпге 11 са, который получают экстракцией 01 М фосфатным буфером, содержащим 0,2 М НаС 1 и 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 в течение 12 ч при 4 С при весовом соотношении лампочки светляков - буфер от 1:40 до 1:10. Экстракт лампочек светляков и грубоочищенный препарат пируваткиназы из мыльц кролика соиммобилизуют на бромцианактивированной сефарозе. При иммобилизации используют 50 мг/мл лампочек светляков, концентрацию пируваткнназы варьируют от 3 до 12 мг/ /мл и носителя от 50 до 100 мг/мл. При концентрациях пируваткиназы ниже 3 мг/мл получаются препараты с низкой пируваткиназной активностью, что уменьшает скорость превращения АМФ и АДФ в АТФ и приводит к увеличению расхода реагентов и времени анализа, При концентрациях пируваткиназы выше 12 мг/мл препараты имеют низкую люциферазную активность, что уменьшает чувствительность определения нуклеотидов. При использовании концентрации бромцианактивированной сефарозы при иммобилизации ниже 50 мг/мл происходит потеря дорогостоящих ферментов, вследствие их неполного связывания с носителем, а при использовании выше 100 мг/мл сефарозы получаются препараты с низкими люциферазной, аденилаткиназной и пируваткиназной активностями, которые не дают высокой чувствительности при анализе. Повышение чувствительности определения АТФ и АДФ с помощью соиммобилизованной полиферментной системы по сравнению с растворимой, по-видимому, обусловлено увеличением локальной концентрации ферментов и продуктов вблизи поверхности носителя. Это увеличивает стационарные скорости ферментативных реакций в иммобилизованной полиферментной системе и облегчает диффузионный перенос субстратов и продуктов одной ферментативной реакции к активному центру другой, В соиммобилизованной полиферментной системе уменьшается влияние побочных факторов за счет пространственного разделения ферментов на носителе, уменьшается ингибирующее влияние пируваткиназы на люциферазную реакцию, что наблюдается при работе с растворимыми ферментами. Кроме того, вследствие, локального концентрирования вблизи носителя образовавшаяся АТФ подвергается меньшему гидролизу, чем было бы в растворе. Все эти факторы обеспечивают гораздо большую эффективность соиммобилизованной полиферментной системы по сравнению с растворимойАнализ адениновых нуклеотидов с помощью препарата соиммобилизованных люцифераэы, аденилаткиназы и пируваткиназы проводится следующим образом по схеме: пируваткиназаАдфтфоофо еиолпирти ат люциферазаА(Флоиифеоиитот А(тф++оксилюциферин+неорганич,фосфат+ +Со,+ 11 (3)АТФ определяют с этим препаратом известным методом по реакции (1). Соиммобилизованные с люциферазной аденилаткиназа и пируваткиназа не влияют на чувствительность определения. Интенсивность излучения прямо пропорциональна концентрации АТФ.Для определения АДФ его сначала превращают в АТФ пореакции (2) при инкубировании с препаратом соиммобилизованных ферментов и фосфоенолпируватом в течение 1 мин. Полученную АТФ определяют аналогично, Для этого. после добавления к смеси люциферинсодержащего буфера регистрируют излу" чение, интенсивность которого пропорциональна концентрации АДФ в системе. Неизвестную концентрацию АДФ определяют из калибровочной прямой.Для определения АМФ его превраща" ют в АТФ по реакциям (1 и 2) инкуби 1317027рованием сначала в течение 30 мин с полиферментным препаратом и цитидин- -5 -трифосфатом (ЦТФ), а затем 1 мин с фосфоенолпируватом. Получающийся АТФ определяют как было указано, Пос ле добавления люциферинсодержащего буфера регистрируют сигнал, который пропорционален содержанию АМФ в системе. Неизвестную концентрацию АМФ определяют из калибровочной прямой. 1 ОС помощью предлагаемого препарата соиммобилизованных ферментов можно определять как общее содержание адениновых нуклеотидов в образце, так и содержание каждого из них в отдель ности, причем для определения АМФ и АДФ необходимо предварительное отделение АТФ от других адениновых нуклеотидов, поскольку содержание АТФ в биологических образцах, как правило, 20 в несколько раз вышее, чем АМФ и АДФ. Отделение АТФ производят с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе.Способ поясняется следующими примерами.П р и м е р 1. Получение препарата соиммобилиэованных ферментов,50 мг лампочек светляков экстрагируют 1 мл 0,1 М На-фосфатного буфера; 0,2 М НаС 1; 2 мМ ЭДТА; рН 8,0опри 4 С в течение 12 ч, 1 мл экстракта инкубируют с 50 мг набухшей бромциансефарозы и 7 мг пируваткина 0зы в течение 24 ч при 4 С. Осадок промывают по 5 раз попеременно 5 мл 0,02 М Иа-ацетатного буфера (1 М, БаС 1, рН 4,0) и 5 мл трис -ацетатного буфера (1 М БаС 1, рН 8,5), а затем 40 5 раэ по 1 О мл дистиллированной водой и 5 раз по 5 мл 0,1 М трис-ацетатного буфера, рН 7,6, 2 мМ ЭДТА. Концентрация полученной суспензии иммобилизованных ферментов 10 мг/мл, активность 45 люциферазы в препарате - 42000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы - 12 Е/мг носителя.Определение АТФ.1 мп раствора, находящийся в пластмассовой кювете, содержащий 1 мг/мл суспензии соиммобилизованных ферментов, 1 мМ люциферин, 2 мМ ЭДТА, 10 мМ МАЗО в 0,1 М трис -ацетатном буфере рН 7,8 помещают в люминометр и изме ряют фоновое свечение, которое для данного препарата не превышает 0,1 мв Затем к этому раствору добавляют 50 мкл раствора АТФ известной концентрации, не прерывая регистрации свечения. Разность между интенсивностью сигнала в присутствии АТФ и фоновым сигналом пропорциональна концентрации АТФ, Опыты повторяют для растворов АТФ с концентрациями АТФ в том же диапазоне, в котором предполагается вести измерения, На основе полученных данных строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Для полученного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость наблюдается в диапазоне концентраций АТФ 10 пМ,10 мМ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по полученному калибровочному графику, Предел обнаружения АТФ с помощью этого реагента составляет 10 пИ.1Определение АДФ.К 0,7 мл 0,1 м трис -ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в пластиковой кювете для люминометра и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ МяЯО, 20 мМ ацетата калия и 5 мИ фосфоенолпирувата, добавляют 50 мкл раствора АДФ известной, концентрации и 0,1 мл суспенэии соиммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. После инкубирования смеси в течение 1 мин при комнатной температуре кювету помещают в люминометр, добавляют 0;3 мл люциферина до получения в кювете концентрации 1 мМ и регистрируют сигнал, который прямо пропорционален концентрации АДФ в системе. Опыты повторяют для растворов АДФ с концентрациями в том же диапазоне, в котором предполагается вести измерения, На основе полученных данных строят калибровочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АДФ, с помощью которого определяют концентрацию АДФ в неизвестном образце, Для полученного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость наблюдается в диапазоне концентрации АДФ 10 пМ - 0,10 мМ. Предел обнаружения АДФ для этого ферментного препарата составляет 10 мИ.Определение АМФ.К 0,6 мл О,1 М трис -ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в кювете, и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ МАЗО 20 мМ ацетата калия и 1 мМ ЦТФ, добавляют 50 мкл раствора АМФ известной1317027 концентрации и 0,1 мл суспензии соиммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. Смесь инкубируют в течение 30 мин, перемешивая, после чего добавляют 50 мкл 0,1 И фосфоенолпирувата, Кювету помещают в люминофор и через 1 мин вводят 0,2 мл люциферина (концентрация его в клозете 1 мМ) и регистрируют излучение. Поскольку интенсивность биолюминесценции про- О порциональна концентрации АМФ в системе, то используя известные концентрации АМФ в том диапазоне, в котором предполагается вести измерения, строят калибровочный график. Неизвестную 5 концентрацию АМФ находят по сигналу биолюминесценции, используя калибровочную прямую, Для данного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость по АМФ 20 наблюдается в диапазоне концентраций 1 нМ - 0,10 мМ. Предел обнаружения АИФ для данного ферментного препарата составляет 1 нМ.П р и м е р 2. Получение препара та соиммобилизованных ферментов.Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 3 мг пируваткиназы при тех же концентрациях всех остальных ве- З 0 ществ. Полученный препарат обладает люциферазной активностью 55000 мв/мг носителя и пируваткиназной активностью 8 Е/мг носителя.Определение АТФ с полученным фер ментным препаратом проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых концентраций АТФ и предел обнаружения АТФ такие же, как в примере 1.Определение АДФ проводят также, 40 как в примере 1, Чувствительность анализа не зависит от концентрации используемой при определении суспензии, Диапазон определяемых с данным препаратом соиммобилизованных фермен тов концентраций АТФ составляет 50 пМ - 0,1 мМ, Предел обнаружения - 50 пИ. Определение АМФ проводят также, как в примере 1, Диапазон определяемых концентраций АМФ 1,0 нМ - 0,1 мМ, Предел обнаружения АМФ - 1,0 нИ.П р и м е р 3. Получение препарата соиммобилизованных ферментов,Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 12 мг пируваткиназы при всех прочих равных концентрациях и 6условиях, Полученный препарат имеетактивность люциферазы 35000 мв/мгносителя и активность пируваткиназы.25 Е/мг носителя.Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводяттакже, как в примере 1. Сигнал биолюминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне 50 пМ -0,1 мМ. Предел обнаружения АТФ -50 пМ,Определение АДФ проводят также,как в примере 1. Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АДФ - 50 пМ -0,1 мМ,Предел обнаружения АДФ 50 пМ.Определение АИФ проводят также,как в примере 1. Диапазон определяемых с данным ферментным препаратомконцентраций АМФ составляет 5 нИ -0,1 мМ. Предел обнаружения АМФ 5 нМ.П р и м е р 4. Получение препарата соиммобилизованных ферментов.Препарат получают также, как впримере 1, но при иммобилизации используют 100 мг бромцианактивированной сефарозы, В полученном препаратеактивность люциферазы составляет25000 мв/мг носителя и активностьпируваткиназы 9 Е/мг носителя.Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводяттакже, как в примере 1. Сигнал био 3люминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне, 0,1 нМ - 0,1 мМ,Предел обнаружения АТФ - 0,1 нМ.Определение АДФ проводят также,как в примере 1, Диапазон определяемых с данным препаратом концентрацийАДФ составляет 0,1 нМ - 0,1 мМ. Предел обнаружения АДФ - 0,1 нМ,Определение АИФ проводят также,как в примере 1, Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АМФ составляет 5 нМ 0,1 мИ, Предел обнаружения АИФ -5 нИ,С помощью полученных препаратовсоиммобилизованных на бромцианактивированной сефарозе люциферазы, пируваткиназы и аденилаткиназы возможно определять как сумму всех адениновых нуклеотидов в образце, так исодержание каждого из них в отдельности (последнее реально при условииотделения АТФ от АИФ и АДФ),Наилучшими полиферментными препаратами, позволяющими определять всеФормула изобретения Составитель Л.БорисоваТехред М.Ходанич Корректор Л,Патай Редактор И.Сегляник Заказ 2394/23 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 13170 адениновые нуклеотиды с высокой чувствительностью вплоть до концентраций 10 пМ являются препараты, в которых при иммобилизации на 50 мг/мл лампочек светляков использовались пируваткиназа в диапазоне концентраций.от 3 до 12 мг/мл и носитель бромцианактивированная сефароза в диапазоне концентраций 50-100 мг/мл. Препараты, полученные с меньшей и с 1 О большей концентрацией пируваткинаэы и носителя, чем указанные в диапазоне, обладают меньшей чувствительностью, и их можно использовать для определения адениновых нуклеотидов с 15 концентрациями не ниже 1 нМ.Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа определения АТФ и АДФ в сотни раз по сравнению с известными методами. С исполь зованием полученного препарата соиммобилиэованных ферментов способ определения становится проще. За счет сокращения числа операций, увеличивается экономичность процесса; умень шается его стоимость за счет использования неочищенных ферментов, воэможности многократного использования одного препарата и увеличения стабильности ферментов после их иммоби лизации. Полученный препарат может быть использован в научных целях для изучения метаболизма адениновых нук 27 8леотидов различных биологическихобъектов, а также для определенияактивности АТФ, АДФ и АМФ - зависимыхферментов. Он может также использоваться в целях медицинской диагностики, в пищевой промышленности имикробиологической промышленностидля контроля за уровнем адениновыхнуклеотидов. Способ количественного определения адениновых нуклеотидов, предусматривающий проведение ферментных реакций с использованием люциферазы, аденилаткиназы лампочек светляков Ецс 1.о 1 а щпяге 1 са и пируваткиназы с последующей регистрацией продуктов биолюминесцентным методом, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращения расхода ферментов, для проведения ферментативных реакций используют неочищен" ные люциферазу и аденилаткиназу лампочек светляков и грубоочищенную пируваткиназу из мышц кролика, подвергнутые соиммобилиэации на бромциансефарозе при массовом соотношении лампочки светляков : пируваткинаэа : бромциансефароза 50:(3-12); :(50-100).