Способ дезинтеграции микроорганизмов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 09) 01) ИТЕТ СССРЙ ИОТКРЫТИЙ СУДАРСТВЕННЫЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕ(71) Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения АН СССР(56) Авторское свидетельство СССР У 977487, кл. С 12 М 1/100, 1979.Патент США У 3511447, кл.241-172, опублик. 1970.КеЬасек 3. 1 опгдпцопцв Мвпге 8 гос 1 опой в 1 сгоогеапдвюв 1 п пеМ ЬаЬогайогу Аррагагцв Ехрег 1 епг 1 с 27, Раве 9. (1971) Ваге 1 вечз.вв, р. 2-3. а) 4 С 12 М 1/00, В 02(54)(57) СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривающий заполнение емкости дезинтегратора суспен-:зией микроорганизмов и мелющими телами, взятыми. в количестве от 50 до853 объема емкости, сообщение последним движения и перемешивание суспензии микроорганизмов, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с цельюповышения степени дезинтеграции иулучшения качества дезинтеграта,непосредственно после сообщения мелю-,щим телам движения увеличивают соотношение между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости до 85-1002.Изобретение относится к биотехнике и может быть использовано вмикробиологической промышленности, вобластях народного хозяйства, использующих методы биотехнологии, а такжедля тонкого и сверхтонкого измельчения материалов.Целью изобретения является повышение степени дезинтеграции и качества дезинтеграта.Цель достигается путем созданиявысоких напряжений сдвига и сжатияпри дезинтеграции клеток мелющимителами,Согласно способу дезинтеграциимикроорганизмов емкость заполняютмелющими телами, взятыми в количестве от 50 до 85 от объема емкостидезинтегратора, затем суспензиеймикроорганизмов сообщают им движение и перемешивание, непосредственно после сообщения мелющим теламдвижения увеличивают соотношениемежду насыпным объемом мелющих тели объемом емкости до значений от85 до 100%.Изменение соотношения междуобъемом мелющих тел и объемом емкости осуществляют изменением объемаемкости, добавлением мелющих тел,изменением центробежных сил, подвергая емкость и мелющие тела колебаниям и так далее.Изменение соотношения между насыпным объемом мелющих тел и объемомемкости деэинтегратора в сторону увеличения от меньшего к большему вызывает уплотнение мелющих тел - увеличение насыпного количества мелющихтел, приходящееся на единицу объемакамеры или рабочей зоны емкости,гденаходятся мелющие тела при дезинтеграции. Перемешивание и взаимодействие мелющих тел при достижении между насыпным их объемом и объемом емкости 100% и более, особенно при использовании полимерных мелющих тел, достигается за счет сжатия мелющих тел (шариков) в пределах упругой деформации. Сжатие на незначительную величину каждого шарика вызвано движением мешалки и прилегающих к ней слоев шариков, которые, вклиниваясь между соседними шариками, деформируют их, передавая деформацию всем остальным шарикам, увлекают их за собой. При движении смещаются слои шариков 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 относительно один другого. Например, при длине камеры 200 мм, диаметре шариков 0,2 мм, деформации каждого шарика на 0,25(0,0005 мм) получают количество шариков в зоне линии, проведенной вдоль камеры 200:0,2 =1000, деформация более 1000 х х 0,0005=0,5, что более диаметров двух шариков. Таким образом, при незначительной деформации каждого шарика на доли микрона возможно перемещение шариков относительно один другого в зоне их перемешивания.Способ осуществляется в емкости объемом 0,3 л баллистического дезинтегратора МЛили в любом дезинтеграторе с :мкостью в виде тела вращения следующим образом.П р и м е р 1. В емкость дезинтегратора, свободно заполненную мелющими телами в сухом состоянии (50% от объема емкости), заливают 10 -ную суспензию микроорганизмов ЯассЬагошусез зегеузае. Объем дезинтегрируемой суспензии 200 мл. Включают дезинтегратор, сообщают мелющим телам движение и перемеливаФют суспензию микроорганизмов, устанавливают частоту вращения вала 100 об/мин и через штуцер для загрузки мелющих тел непосредственно после сообщения мелющим телам движения досыпают в емкость мелющие тела вручную или автоматически, следя по амперметру за началом увеличения тока питания дезинтегратора, после чего досыпку тел прекращают. Увеличение тока показывает, что мелющие тела уплотнились и выбрали свободное пространство в емкости, т.е. увеличилось соотношение между насыпным объемом мелющих тел и объемом емкости от 50 до 100Переключают частоту вращения вала дезинтегратора на 3000 об/мин и одновременно включают секундомер и насос подачи суспензии в режим циркуляции.Производительность насоса 500 мл/мин. Через 1,5 мин деэинтегратор выключают. Дезинтеграт сливают через выходной штуцер камеры или после расстыковки емкости с приводам.Иикроскопированием определяют эффективность дезинтеграции, а также выход белка при дезинтеграции по Лаури. Эффективность дезинтеграции (степень дезинтеграции) 9 15%, выход белка 4,22 мг/мл. Активность тестфермента НАДН-оксидазы 16,2 мЕ/мгбелка,П р и м е р 2. Дезинтеграциюпроизводят в дезинтеграторе с переменным объемом емкости. Заполняютемкость мелющими телами до 857 объемаемкости. Изменение объема достигаютвведением в камеру через дополнительное отверстие в ней твердого вытеснителя. Заливают в дезинтегратор107-ную суспензию микроорганизмовЯассЬагошусез сегеузае. Объемсуспензии 200 мл.Включают дезинтегратор и устанавливают частоту вращения вала 100 об//мин и начинают уменьшать объем камеры дезинтегратора, следя по амперметру за началом увеличения тока питания дезинтегратора, после чего уменьшение объема камеры прекращают.Начальный объем 0,3 л, конечный0,255 л, соотношение между насыпнымобъемом мелющих тел и объемом емкости 1007,.Увеличение тока показывает, чтомелющие тела уплотнились и выбралисвободное пространство в емкостидезинтегратора, т.е. увеличился насыпной объем мелющих тел по отношениюк объему камеры. Переключают частотувращения вала дезинтегратора на3000 об/мин и одновременно включаютсекундомер и насос подачи суспензиимикроорганизмов в режиме циркуляции.Производительность насоса 500 мл/мин.Через 1,5 мин дезинтегратор выключают. Дезинтеграт сливают через выходной штуцер дезинтегратора или прирасстыковке емкости с приводом. Затемвыключают насос.Эффективность дезинтеграции определяют микроскопированием; выходбелка. определяют методом по Лоури,Эффективность дезинтеграции (степеньдезинтеграции) составляет 92+53, выход белка 5,26 мг/мл. Активностьтест-фермента НАДН-оксидазы10.7 мЕ/мг белка.П р и м е р 3Все операции вданном примере выполняют, как в примере 1, но дезинтегрируют суспензиюклеток ЕзсЬегдсЬа со 1 д штамм К 10.концентрацией 4,6 г/100 мл.Эффективность дезинтеграции90 ф 52, выход белка 4,0 мг/мл. Активность тест-фермента НАДН-оксидазы26,8 мЕ/мг белка,Во всех примерах используют мелющие тела: шарики 0,25-0,4 мм из стирола с дивинилбензолом. Внутренний диаметр емкости 70 мм.П р и м е р 4. При дезинтеграциитакой же суспензии ЕзсЬегдсЬда со 1 д,как и в примере 3, в емкости объемом0,04 л с выполнением операций, какв примере 1, было получено: эффективность дезинтеграции 85.57., выходбелка 3,78 мг/мл. Активность тест фермента НАДН-оксидазы 22,5 мЕ/мгбелка.Для сравнения результатов в примерах 3 и 4 проводилась дезинтеграция .в емкости дезинтегратора ФУГстакими же мелющими телами и суспензией микроорганизмов в течение20 мин. Эффективность дезинтеграциинизкая (от 9 до 57), в связи с чемвыход белка не измерялся.20 Для дезинтеграции бактерий дезинтеграторы с полимерными мелющимителами не используются из-за низкойэффективности дезинтеграции.Способ позволяет дезинтегрировать 25 бактерии полимерными шариками, чтоулучшает качество дезинтеграторов иудешевляет процесс дезинтеграции,так как стоимость полимерных шариков в десятки раз ниже, чем стеклянныхП р и м е р 5. Дезинтеграциюпроводят, как в примере 2. Заливаютв камеру 107-ную суспензию клетокЕпйотусез шаугцзсе, объем суспензии 100 мл, уменьшая при этом насыпной объем мелющих тел в пределахот 100 до 603 от объема камеры.Производительность и эффективностьдезинтеграции при этом не снижается,так как оболочки этих клеток менеепрочны, чем клеток приведенных в примерах 1-4, а качество субклеточныхструктур - митохондрий, возростает.Одним из показателей качества является получение интактных субклеточных структур, например митохондрий, определяемое величиной дыхательного контроля.Дыхательный контроль митохондрийсоставляет 2,8, что выше дыхательного контроля митохондрий, полученногопо способу-прототипу 1 9.Производительность предлагаемогоспособа в 2 раза выше при болеевысоких (на 117) эффективности дезинтеграции и выходе белка (на 31,5 Х),повьппается качество продуктов дезинтеграции, возможна дезинтеграциябактерий полимерными шариками.ЪИспользование способа повышает производительность и качество дезинтеграции. Составитель А. ГорбачеваРедактор М. Недолуженко Техред О.Гортвай Корректор В. Синицкая Заказ 1553/34 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб.д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгорол, ул. Проектная, 45 1От воздействия сил сдвига и смятия клетки, попадающие между мелющими телами дезинтегрируются.В процессе дезинтеграции вовлекаются все мелющие тела, После заполнения емкости дезинтегратора суспензией микроорганизмов и мелющими телами, взятыми в количестве от 50 до 853 объема емкости, изменением насыпного объема мелющих тел при , дезинтеграции управляют производи тельностью дезинтеграции эа счет изменения сил сдвига и смятия.За счет увеличения соотношения между насыпным объемом (уплотнения) мелющих тел и объемом емкости. до 221238 а:85 в 1003 непосредственно послесообщения мелющим телам движениясоздают высокие напряжения сдвигаи смятия, чтобы перевести дезинтеграцию из высокоскоростного процессав низкоскоростной, а это, в своюочередь, снижает мощность, расходэнергии, уменьшает тепловыделениеи упрощает термостабилизацию, сни жает затраты на изготовление и обслуживание дезинтеграторов, упрощает ихконструкцию, повышает надежность.