Способ получения сибиреязвенных протективных антигенов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 61 К 39/ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВ ЬСТВ вакробс,140 дицинисм прозвенГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТеНИЙ И ОТНРЫТ(56) Сб. тр, МНИИЭМ МЗ СССР ЯМиные антигены", М 1978, т.ХХ,142.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННИХПРОТККТИВНИХ АНТИГЕНОВ(57) Изобретение относится к меской микробиологии, может бытьпользовано в вакциносывороточнойзводстве прн получении сибирея ЯО 1282381 А 1 ной токсоидной вакцины, а также видослецифичной сибиреязвенной антисыворотки. Цель изобретения - увеличение выхода антигенов за счет исполь- зования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла. В качестве фильтра используют колонку из пористого стекла с размеромапор 700 - 2000 А. Это позволяет в ус ловиях колоночной хроматограФии одновременно и стерилизовать токсический культуральный фильтрат и адсорби" ровать из него не только антигены ЕР - 1 и ЬР - 111, но и 883 РЛ. Элюцию ведут последовательно солевьс 4 раствором и дистиллированнои водой в условиях колоночной хроматографии.3 табл.128Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к вякцннно-сывороточному производству и может быть использовано для полу" чения сибиреязвенной токсоидной вакцины и нидоспецифической сибиреязвенной антисыноротки.Цель изобретения - увеличение выходя антигенон за счет использования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла.Вместо набора Фильтров из обычного стеклянного порошка или стеклянных баллотини в качестве Фильтра используют колонку иэ пористого стекла сконтролируемым размером пор (700- 2000 А), которое позволяет н условиях колоночной хроматографии одновременна и стерилизонать токсический культуральный фильтрат, и адсорбиронать иэ него не только антигены ЕГ - 1 1.Г - 111, но и 883 РА - П, Большая скорость протекания токсиначерез пористое стекло (выдерживающеевысокое давление) и большая сорбцибнная его емкость делает процесс получения высокопроизводительным н простым. Кроме того, использование для элюции помимо соленых растворов дистиллированной ноды позволяет на 207 увеличить выход адсорбированных на стекле протектинных антигенон. Пористое стекло с контролируемым размером пор (СКП) представляет собой тонко измельченный порошок, каждая частица которого пронизана большим количеством пор, контролируемого размера (от 700 до 2000 А). Выпускаемые отечественной промьшленностью марки СКВ представляют достаточно однородный материал, размер диаметра пор укоторого колеблется в пределах 20 Е иха 1 актериэуется высокой скоростью протекания через них жидкостей, Способ поясняется следующим примером.П р и м е р, О л токсичного куль.турального центрифугата, обладающегоотечной, защитной и летальной активностью, фильтруют на холоду (4-8 С) через колонку 40 х 500 мм, заполненную СКП с размером пор 700-2000 Л, предварительно хорошо отмыв ее дистиллированной водой, Скорость фильтрации 200-400 мм мин /смЗатем колонку отмывают от несорбированных антигенон охлажденным эабуференным (0,01 и к-к фосфатЛлй буфер рН 7,4) 0,9 Х-ным раствором ИаС 1, Собранный 2381 2раствор объединяшт с фракцией токсина, прошедшей через колонку ("ф").Антигены, сорбированные на колон"ке, элюируют охлажденным до 4 С)0,3 И карбонатным буфером рН 9,6.Элюат собирают с помощью коллектораФракций по 20 мл. Выход антигеновтестируют по оптической плотности при280 н р (ОП 280),10 После того, как оптическая плотность элюата снизится до с 0,050, колонку начинают отмывать дистиллиронанной водой и вновь собирают элюированные антигены.15 Собранные Фракции антигенов концентрируют методом ультрафильтрациина мембране РИПОР - 4, а затем диалиэуют против 0,02 М аммонийацетатногобуфера рН 7,0.20 Полное Фракционирование завершается в течение 2,5-6 ч в занисимости от.установленной скорости фильтрации.Для восстановления колонки дляпоследующего Фракционирования ее промывают 0,6 л горячей азотной кислоты,а затем дистиллированной водойОценка биологической активности.токсина и его Фракций.Протективную активность оцениваютЗО на морских свинках. Нивотным вводятподкожно по 10 мкг (по белку) препара.та в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Заражают через 20 дней после им 6мунизации 1:10 спор сибиреяэвенногоштамма 71/12. Гибель животных учитывают в течение 10 дней.Летальную активность оценивают нафинбредных мьппах линии СС 57 ВК либо40 ВАЯВ/с. Внутривенно вводят препаратв объеме 1 мл. Гибель мьппей регистрируют в течение 5 днейОтечную активность оценивают наморских свинках. Внутрикожно вводятпо 0,2 мл препарата. Отек оцениваютпо толщине кожной складки (в мм) посравнению с контролем.Антигенный состав фракций исследуют н иммунозлектрофореэе против50 видеоспецифической противосибиреязвенной сыворотки,Фактор РА - 11 но фракции "Ф",прошедшей через СКП не сорбируясь,тестируют в виде термолабильного ком 55 понента (инактивируется при 56 С втечение 30 мин), реагирующего с ви-,доспецифической антисывороткой. Рф "11 иэ других Фракций токсина идентиФицируют по вышеуказанному препарату1282381 Оснонйое достоинство предлагаемого способа по сравнению со способом- прототипом заключается н том, что при этих условиях происходит адсорбция на стекле не двух, а трех видов протективных антиге 0 он, кроме того, предлагаемые условия элюции позволяют увеличить на 207. вьгход адсорбированных протективных антигенов. Эти достоинства предлагаемого способа позволяют увеличить в 2 раэа выход очищенных протектинных антигенов и обогатить состав очищенных протективных антигенон фактором РА - 11.Кроме того, применение колоночной хроматографии на пористом стекле с . контролируемым размером пор позволяетувеличить производительность процесса получения, сократин затраты времени, упростить процесс, соединив воедино процессы стерилиэующей фильтра" ции и очистки, а также уменьшить число операций и тем самым сделав возможным его автоматизацию, применять предлагаемый способ для промьппленного производства.Увеличение, ионной силы элюирующих растворов (до 1 М МаС 1 и до ЗМ БНБСН) с одновременнымснижением рН до 7,0 либо снижение ионной силы до 0 (дис- тиллированная вода) и рН до 6,0 позволяет увеличить выход антигенов с колонки на 18-207. При рН ниже 6,0 наблюдается быстрая утрата биологической активности протективных анти- генов, (табл.2),Таким образом, поставленная цель - улучшение качества препарата и увеличение его выхода - достигается благо-. даря двум основным отличительным осо бенностям предлагаемого способа, а именно, применению, порошка из пористого стекла, с контролируемым размером пор, адсорбирующего эффективнее и полнее протективные антигены, чем порошок из непористого стекла, при этом размер пор стекла в указанных пределах (700-2000 А) не влияет ре" шающим образом на его адсорбционную способность (табл.З), а также более полному снятию со стекла адсорбиронанных антигенов и исгользованию для элюции соленых растворов в более широком диапазоне концентраций (от 0 до ЗМ) и рН (6,0-9,6). Предложенная нами дополнительнаяэлюция дистиллированной водой позволила увеличить выход ЕР - Т на 987 и1,Р - ТП на 317 (табл.1).Иэ общего количества РА - 1 Т, выделенного иэ 10 л токсина, 127. содержится во Фракции фильтрата "Ф" и887но фракции люата, тогда какЕР - 1, Т,Р - 111 обнаруживается только во Фракции элюата. 50Степень очистки проективных антигенов но всех Фракциях элюата (Эь,Э и Э ) по сравнению с фракциейФильтратл (Ф) достигает 79-85 - кратности. 55Таким образом, предлагаемый способпозноляет получить до 94,67. протективных антигенон (всех трех видов)при 80-кратной их очистке,Формула изобретения Способ получения сибиреязненных протективных антигенов иэ культураль РА - 11 н реакции иггмуггодифуэии поУхтерлоне.Фактор 1,Р - 111 идентифицируют поспособности давать н соединении сФракцией РА - 11 смесь, летальнуюдня,пггей СС 57 ВВ и ВАТ,В/с. ФакторЕР - огге;:г. .эт по уровню аденилатциклаэной ктинности (н нг на 1 мгбелка н 1 мин), тестируемой дп ггорадиоиэотопным методом. Белок определлют методом Лоури.Распределение факторов токсина поФракциям, полученным с колонки СКП,оценивают по количеству белка (в мг)в препаоатах ЕР - 1, РА - Т 1 и Т.Р - 15111, полученных в результате последующей огистки,Па отп;ой колонке, содержащей500 см СКП, были последовательнозггггакггиониронаны 4 серии токсина, г 20.абае;.;-.ж по 10 и и получены сходныеггройги,пи элюции янтигенных фракции,В "оотнетствии с кривой элюцииьг.тигеггы, элюиронанные О,З М карбонатным буфером, можно разделить на 25две фракции, восходящую (Эь) и нисходящую (Э ), и выделить антигены,пэлюиронаггные цистиллиронанной водой),Из;. гение биологических свойств 30этих фракций показало, что элюированные антигены (Эь+Э+Э ) обладали выражеьгнтги протектинной, отечной илетальной активностями.Элюция сорбированных на СКП Факто рон токсина происходит в следующейпоследовательности (табл.2), сначала РА - 11 и Т,Р - 111 (Э и Э), азатем ЕР - 1 и Т,Р - Т 11 (Э и Э),5 1282381 6ного фнльтрата путем их адсорбции пористого стекла с размерами пор вна стеклянном порошке с последующей пределах 700-2000 Я а злюцию ведутэлюцнеГ ол и ч а ю щ и й с я тем, последовательно голевым растворомчто, с целью увеличения выхода про- и дистиллированной водой в условияхдукта и сокращения времени, в качест колоночной хроматографии.ве адсорбента используют порошок изТаб лица 1Распределение сибиреязвенных прЬтективных антигенов,во фракциях, полученных предлагаемым способомиз 1 П л токсина ЬРРАФракции ЕУмг Жа мг Фильт"нФ 0 0,92 5,3 0 0,92 12 0 Элюат 5,86 35,2 7,1 42,2 2,9 17,3 1,84 30 2,86 47 1,47 23 3,85 50 О 1 б 5 491,3 451,43 50 Э 2,94 38 0 0 ЭВсего 1 б,7 100 6,1 100 7,7 2,9 100 таблица 2 80-82 Винана ионной сюж и рй на элна 1 ив адсорбированнмк а СКП авгенов Количество белка полученногопри разных варнантак злнцнниг йнд буферногораствора Послэдовательные зтапи злкцин Коцентрали соли 11 . 3 7,2 7,7 9,6 0 ЭИ КарбонатньЮ Меаоиийацетатный , , 7,0 0,02 И,1 И На 01 18 Аииоинйаавтатиый 18 7 1,8 7,0 0,02 изм ин ась 2 1,8 20 6,0 , 0 Всего злкироваи"ного быка 94 96 90 106 е те Ф ФФЧерез колонку 2 к 35 си) заполиеинук СКП (2000 6 100 си ) фильтровали по 1 л токсина.8Та блица 3 1282381 Влияние размера контролируемых пор стекла на адсорбционную емкость стеклянного порошка,Количество Опыт Размер пор стекла, 1элюнров анного белка, мг 5 700 80 20 80 6,2 20 1200 80 5,9 20 2000 сЧерез колонку фильтровали 1 л токсина,. Адсорбированные настекле антигены последовательно элюировали 0,3 М карбонатнымбуфером рН 9,6 и дистилЛирОванной водой. Составитель П. БондаревРедактор Л. Волкова Техред Л;Сердюкова Корректор М. Пожо Заказ 873 Тираж 445Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, й"35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 Объем порошка изпористогостекла вколонке