Способ определения биогенных моноаминов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК И 9) (11) 4 С 01 4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Инститбиохими ольская и А,К,Ар 295. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ИЯТКРЫТИЙ(56) Биохимия, 1982, В 2,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОГЕННЫХМОНОАМИНОВ(57) Изобретение касается физикохимических методов анализа и можетбыть использовано в медицине и фармакологии, Цель изобретения - повышение чувствительности способа, Биоспецифический катализатор с моноамкноксидазной активностью помещаютна мембрану ячейки 8, которую размещают в сосуде 1 для измерений, до-,бавляют в сосуд боратный буфер и про1282006бу крови. Сосуд 1 закрывают, помещают капилляр 6 вводят в смесь едкий натв термостат, включают магнитную ме- рий. После установления постоянного шапку и проcускают кислород. Затем значения потенциала на электроде запоток кислорода перекрывают и в за- писывают показания потенциометра. По крытом сосуде производят перемешива- градуированной прямой находят значение, После инкубации яейку 8 выни- ние концентрации моноаминов. В примают. В сосуд добавляот хлористый сутствии ацеклидина полученное знакалий, Сосуд охлаждают, закрывают чение соответствует сумме концентрапробкой 3 со стеклянным электродом 4. ций тирамина и бензиламина, 2 з.п. Снова пропускают кислород и через ф-лы, 3 ил.Способ позволяет определить сумЯ 11 ОР количество биогекных моноаминов (ссротонина, бензихамина, тирамина.,р 51 Нця, норядренялика и друг 1 х моноямннон, кроме ядренялиня) а также селективно определять серотонНн и бекзиламцн в смеси мокоамцнов, 1511 е 1 ь изобретения - повышение чувствительности сО Оба, селективкое опр 1 деление серотоникя и бекзилямина за счет использования биоспецифическо О катя 1.1 ятор 1 с моцоячино 2 ксидязно активностью и селективных ицгнб 1 Оров дезямнннровя:Пя моноСпособ осуществляется следующимобразом.0,5 г биоспецифического катализатора с мокоаминоксидазной (МЛО) активностью помещают на мембрану ячейки 8 и промывают 0,01 М растворомборатного буфера (рН 7,6) и бидистил лированцой водой. Ячейку 8 помещаютв сосуц 1 для измерений электрода сгазовым зазором, добавляют туда 2 мл0,1 М боратного буфера рН 7,6, 1 млводы или раствор обратимого ингиби тора. и 1 мл исследуемого растворабиогенкых моноаминов: серотонина,тирамика, бецзиламина или пробу кро-,ви. Измерительный сосуд 1 закрывают,оНомедают в термостят при 35-45 С, 30 вклочаот магнитную мешалку и 10 минпропускают Обез СО. Далее потокО перекрывают и герметически закрыйтый сосуд 1 выдерживают не менее50 мин при 35-45 С и интенсивном перемешивании. После инкубации ячейку 8с ИАО вынимают, в сосуд 1 добавляют1,4 г КС 1, охлаждают сосуд. 1 до 25 С,закрывают пробкой 3 со стекляннымр 11-электродом 4, на поверхность кото рого помещена капля 0,27-ного раствора тритона Хв бидистиллироИзобретен 1 е о;носится к физико химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств мокоаминов в биологичес 1 ких средах, и может быть использовано в медицине и фярмакоаминов, 11 я фиг, 1-3 покязяко устройство для Оп 13 едее 55 моноямиков пУстройство д 151 Определения количРствя мо 1 ояиков в 61 Ологических срРдях сОцержн 1тРК 1 янный сосуд 1 со.ялифом (объем сосуда 17,7 мл). Сосуд герметично закрывают стеклянной трубкой со ифо 2, Б трубку вставляется резиновая пробка 3 со стеклянным рН-электродом 4, электролитическим мостиком 5 и иглами-капиллярами 6, Коцец электролитическо го мостика 5 выведен на чувствительную поверхкость рН-электрода 4, Для большей надежности, герметичности резиновую пробку 3 заливают герметизируощим слоем парафина, Иглы-капилляры 6 используют для добавления необходимых компонентов в реакционную смесь 7 (объемом 4 мл) и пропускания кислорода. через газовый зазор, В стеклянный сосуд 1 помещают ячейку 8 с биоспецифическим катализатором с моноаминоксидязной активностью.Ячейка 8 (фиг.2 и 3) содержит два кольца 9 и 10, прилегающих друг к другу и скрепленных полупроницаемой мембраной. В одном из колец вмонтирован магклтик 11 для магнитной мешалки.3 12820ванной воде, снова пропускают О безСО и затем через капилляр б вводятв реакционную смесь 0,2 мл 1 М Г 1 аОН(рН раствора ) 12) для полного высвобождения ИН . После установления3постоянного значения потенциала (рН),т,е, через 20 мин, на электроде записывают показания потенциометра(рН-метра), Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов, соответствующее значению.апотенциала, В присутствии (2,5-,5) 10 Мацеклидина полученное значение соответствует сумме концентраций тирамина и бензиламина при концентрацииацеклидина и метацина (1.8) 10 " Мсоответствует концентрации бензиламина, Чувствительность способа210 К,20П р и м е р 1, 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раство-. ром боратного буфера (рН 7,6) и би дистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда. 3 мл 0,15 М раствора КС 1 или Г 1 аС 1 и 0,5 мл исследуемой крови че ловека, Измерительный сосуд закрывают, помещают в термастат при 35 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0без СО, Далее поток О перекрывают и герметически закры тый сосуд 1 выдерживают 60 мин прио35 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ячейку 8 с МАО вынимают, в сосуд 1 добавляют 1,4 г КС 1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают 40 пробкой 3 со стеклянным рН-электродом 4, на поверхность которого помещена капля 0,2 Б-ного раствора тритона Хв бидистиллированной воде, снова пропускают О беэ СО и затем 45 через капилляр вводят в реакциопную смесь 0,2 мл 1 М Г 1 аОН (рН растворами 12) для полного освобождения Г 1 Нз После установления постоянного потенциала (рН), т,е, через 20 мин 50 на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра), Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих лоноаминов, соответствующее значению потенциала, 55Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание Г 1 Н ) проз водят описанный опыт, только в состав реакционной смеси вместо 0,5 г био 06 4специфического катализатора с МАОактивностью прибавляют 0,5 мл 0,0 1 МК-Фосфатного буфера рН 7,6.Содержание аминов в крови рассчитывают как разность между общим количеством аммиака и Фоновым количеством аммиака.Получают, что общее количествомоноаминов в крови человека 0,36 мкг/млкрови,П р и м е р 2, 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранамиячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) ибидистиллированной водой. Ячейку 8помещают в сосуд 1 для измеренийэлектрода с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 Мрастворе КС 1 (1:1), 1,7 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 10 Мраствора серотонина, 0,24 мл 5 10 Мбраствора тирамина и 0,24 мл 5 10 ьМраствора бензиламина, Таким образом,концентрации в реакционной смеси се 7 "Рротонина 4"10 М, триамина 3 10 М,7бензилаляна 3 10 М. Общая концентрация моноамипов в реакционной смеси1 10 Г 1,Измерительный сосуд закрывают,помешают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО . Далее поток Оперекрывают и герметически закрытыйсосуд 1 выдерживают 50 мин при 45; Си интенсивном перемешивании. Далеепроводят все операции аналогично примеру 1.Находят по градуировочной прямойзначение концентрации моноаминов-б110 М, соответствующее значениюпотенциала, Имеющееся количество моноамипов в разбавленной крови ничтожно и на результат не повлияет. П р и м е р 3. 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 М растворе КС 1 (1:1), 1,5 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 10К раствора серотонина, 0,24 мл 5 10 М раствора триамина, 0,24 мл 5 10 М раствора бензиламина и 0,2 мл 5 10 М раствора5 12820 ацеклидина (концетрация ацеклидина в реакционной смеси 2,510 М).Измерительный сосуд закрывают,о помещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0. беэ СО. Далее поток 0перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдераживают 50 мин при 45"С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично при- Ю меру 1.Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов (6,05 10 М). В примере 2 получена общая концентрация моноаминов 1 10 М, можно найти концентрацию серотонина: 1 10 -6,05 10 =3,95"10 М (в анализе концетрация серотонина 4 10 М) .П р и м е р 4 Определение ведут аналогично примеру 3, однако конеч-5 ная концентрация ацеклидина 5 10- 6и 3,75:10 М, Находят концентрацию серотонина соответственно 4,75 10 и 4,0510 М.П р и м е р 5, 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-активностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,0 1 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 З 0 помещают в сосуд 1 для измерений с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 М растворе КС 1 (1:1), 0,9 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 5 10 М раствора се ротонина, 0,24 мп 5 10 М раствора триамина, 0,24 мл 5 10 М раствора6бенэиламина и 0,8 мл 5 10 М раствора ацеклидина (концентрация ацеклидина в реакционной смеси 1 10М). 40 Измерительный сосуд закрывают, поомещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО. Далее поток 02 перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 45 выдерживают 50 мин при 45 С и интен 06 6сивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.По градуировочной прямой определяют концентрацию моноаминов 2,9510 М, что соответствует концетрации бензиламина в реакционной смеси.В примере 3 получена общая концентрация тирамина и бензиламина 6,05" 10М, можно найти концентрацию тирамина: 6,05" 10 -2,95 10 =3,110 7 М.П р и м е р 6. Определение ведут аналогично примеру 5, но концентрация ацеклидина 2, 10 " и 8 10 " М соответственно, Находят концентрацию бензиламина 2,95: 10 7 и 2,80 10 М. формула изобретения 1. Способ определения биогенных моноаминов путем их дезаминирования при помощи моноаминоксидазы с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при помощи рН-электрода, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве моноаминоксидаэы используют биоспецифический катализатор с моноаминоксидазной активностью, деэаминирование проводят в течение не менее 50 мин, а определение аммиака ведутс в присутствии насыщенного раствора хлористого калия при рН не менее 12.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью селективного определения серотонина в смеси моноаминов, деэаминирование проводят в присутствии 2,5 10 -5 10М ацеклидина,3, Способ по п,1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью селективного определения бенэиламина в смеси моноаминов, дезаминирование1282006 Составитель Н.ГуляеваТехред Л.Сердюкова Корректор С.Черни Редактор И.Николайчук Заказ 7259/42 Тираж 77 б Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5