Раствор лизата

1ОП-ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(33) США Государственный комнтет Совета йнннотрав СССР оо делам нзобретеннй н открытнй(45) Дата опубликования описания 13.03.78 6.071 (088.8)(72) Авторы изобретения Иностранец Роберт Е. ХопкинсИностранная фирмалстер Лабора горнз", Инк(71) Заявител 54) РАСТВОР ЛИЗАТА Ионы магния сами по себе обеспечивают хорошую чувствительность протеина .тоов, если они присутствуют совместно с ионами натрия ( не более чем 0,1 моль/л ионов натрия), которые проявляют чувствительность лизатного протеина по отношению к зндотоксину, даже в присутствии других катализаторов. Предтточтительно, чтобы в литре рас. твора присутствовало от 0,5 до 0,3 моль/л МяПредпочтительно имидазол использовать в рас.м творе лизата совместно с ионами Ь т, ионами М 9, тиогликолят ионами (которые мо.ут быть добавле. ны в виде тиогликолята щелочного металла, напри мер тиогликолята натрия) или ионами Яг, Комбинация этих ионов с имидазолом, деиствуюшая как буферньпт агент, обеспечивает высокую чувствитель. ность лизата ца присутствие зндотоксина.Например, при использовании совместно с имидазолом, взятом в предпочтительном интервале кон центраций, приведенном выше, хорошие результаты получают в результате добавления 0,005-03 моль,л ионов 1. т, предпочтительно 0,20,15 моль/л ионов 1.4 или 0,005 - 0,3 моль/л ионов Мсу, прел+ 44 гогтитсльно 0,0 - 0,1 моль/л ионов МцХорошую комбинацию получакп если имила. зол и ионы Мц добавляют в их предпочтительных Изобреение относится к области меди 1 гины и может быть использовано для,диагностических целей.Известен раствор лизата на основе растворимых белков кровяных клеток Епоцв 11. бОднако известный раствор не обладае 1 высокой чувствительностью к эндотоксииу.Целью изобретения является повьииение чувствительности к эндотоксину.Эта пель достигается тем, что он дополнитель. О но содержит по крайней мере один компонент. выбранный из следующих групп: ионогенное соединение магния, лития, стронция, бария, имидазола, цис теина в концентрации 0,005 - 0,3 моль/л раствора.Эти компоненты могутрисутствовать в раство. 5 ре лнзата в следующих концентрациях: нмидазол 0,004 - 0,4 моль/л, предпочтительно 0,01 - 0,3 моль/л, марганец, предпочтительно в виде ионов ( Мп ) в количестве 0,005-0, моль/л, ионы стронция (Яг ) обычно 0,005 - 0,4 мольл, предпочтительноФ 40,01 - 0,3 моль/л ионы бария (Ва ) обычно 0,005 - 0,5 моль/л в присутствии буфера для создания рН 7 - 10, цистеин - обычно в концентрации 0,005 - 0,3 моль/л) ионы лити 51 ( Ьт ) 0,0050,3 моль/:1, предпочтительно 0,3 - 0,15 моль/л.3конценттациях, а ионы тиогликолята добавляют сконцентрацией 0,005 - 0,008 мольл раствора,Хорошие результаты получают при добавлениик имидазольному раствору ионы стронция Зг вконцентрации 0,02 - 0,15 мольц.бПриведенные выше положительно заряженныеионы можно добавлять к раствору в виде соответ.ствующих хлоридов.Ионы стронция обычно добавляют в виде хлорида стронция, ионы бария (Ваиспользуют совФФместно с буфером и эквивалентными буфернымиагентами, особенно в том случае, когда буфер при.сутствует в такой концентрации, чтобы обеспечитьрН 7 - 10,Известны и эквивалентные сульфогидрильньа. 15соединения, такие как глютатион, тиогликолят ще.лочного металла или тиоурацил, проявляннцие снособность повышать чувствительность лизата. Хоро.шие результаты получают тогда, когда гидрохлоридцистеина нейтрализуют до рН 6 - 10 щелочным ве 0ществом, таким как гидроокись натрия, карбонаткалия, гидроокись тетрабутиламмония, а также прииспользовании в растворе лизата 0,02 - 0,2 вес.%сульфогидрилсодержащего соединения, такого каацистеин или 1 иогликолятная соль щелочного метал-ла, 0,2 - 2 вес.% воднорастворимой соли магния, такой как хлористый магний,Ионы лития вводят с хлористым лигием илиподобными солями лития, имеющими растворимыйанион, для повышения чувствительности, 30Каталитические или повьппающие чувствнтельность агенты используют путем первоначальногорастворения в дистиллированной воде в желаемыхконцентрациях, После этого полученные растворыиспользуют для перестройки лиофилизированного 85лизата путем растворения лизата в этом растворе.Растворы лизата обычно готовят непосредствен.но перед использованием из-за их повышенной чув.ствительности по отношению к эндотоксину, кото.рая повышает вероятность их осаждения из-эа на 40личия случайных примесей, что имеет место придлительном хранении.Раствор лиэата - это водный раствор, свобод.ный от пирогенов, использование которого позволяет избежать преждевременного осаждения лизата, 45однако могут быть использованы и неводные растворители, такие как метанол, этанол, изопропанол,ацетон, этиленгликоль и друтие, которые могуттакже использоваться в смеси с водой, при необходимости. 50П р и м е р 1. Собирают Атлантических ме.чехвостов (1.пшоа роурЬепаа) и помещают их вштатив таким образом, чтобы удерживать в положении, при котором их брюшные стороны находятся сверху. Стык между двумя первыми сегментами 55крабов (простома и опситома) подготавливают врезультате протирания спиртом. Затем в место сочленения вводят иглу для отбора крови, которуюустанавливают на конце сосуда для крови, но модифицированной таким образом, что трубка для 60 отбора крови имела длину в 5 дюймов (12,5 см).Сосуд содержит 300 мл 3% ного раствора хлористого натрия, в котором растворено 2,87 г этилендиаминтетраацетата ЕДТА) .Из мечехвостов отбирают в сосуд для сборакрови 300 мл крови.с 4 ва сосуда выбирают и балансируют, если этонеобходимо по весам и затем помещают в центри.фугу на 7 мин прн 17.800 об/мин для того, чтобыотделить клетки амебоцита от крови, В тех случаях,когда кровь хорошо седиментирована, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 ьщн,Вслед за стадией центрифутировання клеткикаждьй сосуд с кровью помещают на наклоннуюплоскость с углом наклона 10 таким образом,.чтобы закупоренный конец трубки для сбора крови был направлен вниз и трубку для сбора кровиеще раз открывают, разрезая ее. Верхний слой пцательно декантируют, оставляя осажденные клетки исосуде, Вслед за стадией декантации трубку длясбора снова запаивают.Затем в одну из двух стерильных дополнительных частей сосудов с кровью вводят с помощью инъекционной иглы 6 вес,ч. дистиллированной, непирогенной воды на каждую 1 вес.ч. клеток,присутствующих в сосуде для осуществления лизи.са клеток. Вес клеток может быть определен в ре.зультате вычитания стандартного сухого веса сосу.да для крови от действительного веса сосуда иклеток, которые содержатся в нем,Дистиллированную воду перемешивают в сосуде для крови и затем дают стоять в течение 24 чпри 4 С, Затем сосуд центрифугируют в течение7 мин, После этого жидкое содержимое каждогонз сосудов пропускают через 170-микрончый фильтрдля отделения его от осажденных твердых веществи помещают в замораживающую среду для получения твердого замороженного состоящи,Замороженный 1 ц 1 цз лизатньй растворзатем пцательно оттаивают, обеспеивая такой режим, чтобы раствор оставался холодным 1 т.е.ниже20 С), После оттаивания лизатный раствор пере.фильтровывают в колбу через дополнительный170-микронньй фильтр.Осадок на фигп треостающийся после фильтрования, представляет собой нежелательныйитериал,который осаждается во время стадии Рымораживания, Затем фнльтрат обычно отфильтроиьвают ещераз через другой фильтр (имеющий номинальныйразмер пор порядка 1,5 мкм с последующей фильтрацией через мембранный фильтр, который имеетабсолютный размер пор порядка 1,2 мкм и номи.нальный размер пор менее этого значения.Перед использованием все фильтры промывали 1 л стерильной непирогенной воды. Последниестадии фильтрации осуществляют в результате ежа.тия лизатного раствора в направления течения через фильтр при помощи давления газообразногогазота, равного приблизительно 0,9 кгсм . С другов603320 ентрапия эндотоксин.ра, способная давать поРеакцию на прочностогра мм/мл) Низшая ко ного раств ложи тельцу тромба, анан 7) 1,56 арзствор У0,39 арзствор Иф0,195 араствор Ие0,39 арзствор Иф0,195 араствор Иф 7 араствор Иф 1 97 араствор Иф 11) 0,097 араствор Ие 11) ин 0,048 (раствор Иф 12) 0,195 араствор И,195 арвствор Иф 10) ъемов:1 6-аминоликоля 95 арзствор Ио 109 (раствор Иф 9) 5стороны, в сборном сосуде можно применять взкуумирование для облегчения фильтрации,После последней стадии фильтрации раствор разделяют на 2,0 аликвоты, которые помещают в 6 мл ампулы или испытательные пробирки, которые тщательно промывают стерильной, не содержа. щей пирогенов водой, и депирогенируют при темпе. рзтуре 245 С в течение 4 ч, Испьпательные пробирки затем ззпвивают, подвергают полочному вымора живзнню в машине для лиофилиэации и сушат ва . холоду до образования сухого порошка.Ряд испытательных пробирок, приготовле:щых как описано выше, подвергают перестройке в виде раствора в результате добавления 5 мл одного из растворов, списанных ниже. 5В каждой серии пустых испытательных проби рок, эа исключением первой пробирки каждой се. рии, добзвляют 0,1 мл непирогенной воды, В первую пробирку добавляют 0,2 мл Е.саб стандартного зндотоксинного раствора. Концентрация испольо зуемого Е соб эндотоксинв доставляет 100 наногрзмм эндотоксина на 1 мл, После этого 0,1 мл раствора из первой пробирки добавляют во вторую пробир. ку; 0,1 мл раствора из второй пробирки добавляют В третью пробирку; и такое добавление продол 25 жвют до образования серий последовательныхиспытательных растворов, каждый из которых содер. жит половину концентрации предыдущих испытательных растворов икнм образом, что двадцатый и по 09 йаС 1 аконтроль)0,085 цистеина НС0,1 цистеина0,001 реагента Клеланда0,2 2 тио-амнноурзцнлаСмесь равйых объемов: 1раствора Мц С и 0,85цистеина НССмесь равных объемов: 1раствора Мц Сг и 0,1цнстеинаСмесь равных объемов: 1М цС 1 г и 0,1 растворатногликолята натрияСмесь а 3:2):1 раствораМц Сг и 0,1 растворатиоглнколята натрияСмесь а 2:1:1):1 раствора Мд Сг 0,9 раствораСаГ 1 г и 0,85 раствора1:цистенна НОСмесь равных обМд 80, 0,2 2.тиоУрацила и 0,1 тиог 6следний испьпвтельный раствор содержал 0,00019 нанограмм эндотоксинв нз 1 мл.К каждому выбранному интервалу раствора в полученных пробирках добавляют 0,1 мп перс. строснного лизатонного раствора.Серии пробирок затем инкубируют при тем. пературе 37 С в течение 60 мин. Затем каждую пробирку переворачивают и отмечают наличие или отсутствие неповрежденного тромба протеию. На. личие протеинового тромба, способного оставаться неразрушенным в результате мягкой инверсии испытательной пробирки, служит указанием полояительной чувствительности реакции лизетв на эндо. токсин. Ниже показано, что природа перестраивзюще го раствора в значительной степени влияет на чув. ствительность лиэата по отношению к зндотоксину представлены различные перестраиваявцие растворы, которые подвергают испьпвнию и перечислены для каждого слувя мзксимально разбавленные рас творы зндотоксию, которые способны вызывать положительную реакцию на прочность тромба 1.1 па. Ьв лизатом 1 после перестройки в специальных рзс. творвх, перечисленных киже.В целях сравнения, при испьпании нв кроли. ке для пврентеральных растворов больших объемов обычный предел детектирования составляет 0,097 нвнограмм эндотоксина на 1 мл. (Раствор 11).6 ОЗЗ О Добавки в используемый пере.странна инций раствор Стерильная вода (контроль) безимида золаБез добавок - только имида. зол оПовторение этого эксперимента с использованием 12 М стерильного имидазольного раствора (рК 7,07) привело в результате к положительной реакции на тромб при концентрации эндотоксина порядка 0,048 нано- грамм/мл (раствор Ио 12),0,097 (раствор И 11) 0,048 (раствор Ио 12) 0,048 (раствор И 12) 0,097 (раствор Ио 1) 0,048 (раствор И 12) 0,2 М ЯгС 20,1 М ЯгС0,05 М ЯгС0,025 М ЯгС 10,0125 М ЯгСг Йизшая концентрация эндотоксина,способная давать положительнуюреакцию на прочность тромба, нанограмм/мл Дополнительные инградиентыперестраивающего раствора Без добавок - только имидазол0,005 М тиогликолята натрия( асИо1) (раствор Ио 12) (раствор Ио 12) (раствор И 1 2) 0,097 0,048 0,048 0,048 0,0025 М тиогликолята натрия 0,00125 М тиогликолята натри П р и м е р 2. Образцы различной партии лио. филизированного .вцОз лизата, полученного в примере 1, подвергают перестройке по способу, описанному в примере 1, с помощью 2 мл перестраиваю 0,1 МС0,5 М С0,025 МС0,0125 М .С0,2 М .СЖМ М 9 С 20,05 М М 9 С0,025 М М 9 С 20,125 М М 9 Со0,00625 М М 9 С 2 П р и м е р 3. Образцы лиофилизированного 1.паоя лизата, полученные согласно примеру 1, подвергают перестройке способом примера 1 с помощью 2 мл перестраивающего раствора, включающего раствора, состоящего из 80 об.5 стерильнойводы и 20 об.% 0,.13 имидазольного.буфера (рН 6,8.и включающего также дополнительные добавки вконцентрациях, указанных ниже. Низшая концентрация раствора эндотоксина, способная давать положитель-. ную реакцию на прочность тромба,наног рамм/мл 3,12 (раствор И 6) и иногда1 56 (раствор И 7)0,195 (раствор И 10)0,097 (раствор И 11) и иногда0,048 (раствор И 12)0,097 (раствор Ио 110097 (рас вор Ио 11)0,097 (раствор Ио 11)0,097 (раствор И 11)0,097 (раствор И 11)0048 (раствор Ио 12)0,048 (раствор Ио 12)0,048 (раствор Ио 12)3,097 (раствор Ио 1) Вщего в свой состав 0,12 М имидазола (рН 7,04), а45также включающий дополнительные инградиентыв концентрациях, указанных ниже.603320 спользуемый перестраиаствор ерильная вода При концентрации 0,78 (раствор И 0 8) не удал оложит цию(рН 9,3)0,2 М ВаС 20,05 М ВаС 1, в рбуфера (рН 9,5 0,39 (раствор И 0 9 019 С (раствор И астворе трис,097 (раство 9П р и м е р 4. Образцы лиофилизированного0 па 1 пз лизата, полученные как описано в примере1, подвергают перестройке способом примера 1 с С, 0,1 М имидазола ииогликолята натрия,ц С 0,05 М имидазола,тиогликолята натрияМц С 0,025 М имидазола5 М тиогликолята натрияМц С 12; 0,0125 М имидазола25 М тиогликолята натрияцС 2; 0,05 М 1 лС 2 и 0,005 М т005 М М0,0025 М0,025 Ми 0,00120,0125 Ми 0,0006005 М М0,05 М иь0,025 М М0,025 М0,1 М Мц0,1 М ими 0,05 М Мц С 12,0105 М 1 С,; 0,05 Мимидазола и 0,0005 М тиогликоля натрия0,025 М Мц С 0,025 Мимидазола и 0,00125 Мнатрия0,1 М 1.С 2, 0,1 М имидазола и0,005 М тиогликолята натрия0,0005 М то же0,00025 М то же0,0000 б 25 то же0,2 М ЯгС 1,0,5 М ЯгС 10,0125 М ЯгС 20,2 М ЯгС, в растворе трис-буфера при рН 9,30,1 М ЯгС: в растворетрис-буфера с рН 9,3 .Раствор трис-буфера (контрольдля данных по влиянию ЯгС,помощью 2 мл различных перестраивающих растворов,как описано ниже.Знцотоксинная чувствительность полученных в результате продуктов представлена ниже(раствор У 10) (раствор а 10) (раствор Р 11) раствор Р1) (раствор 1 а 10) 0,195 0,195 0,097 0,097 0,195 0,097 (раствор У 11) 0,097 (раствор г 1 а 11) 0,195 (раствор Я" 10) 0,195 (раствор У 9) 0,097 (раствор У 11) 0,048 (раствор У 12) 0,097 (раствор И 11) 0,097 (раствор а 11) Составитель С МалютинаТехред О.Андрейко Редактор Н, Потапова Корректор 1:,Палл Тираж 703 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делал 1 изобретений и огкрытий 113035, Москва, Ж, раугиская набд 4/5Заказ 1666/62 Подписное Филиал ППП "Патеси . г. ужгород. ул Проскгиав, 4 10,025 М ВаС 1 г в растворе трис-буфера(рН 9,5)Трис - буфер (контроль для данныхпо влиянию ВаС 1, (рН 9,55)0,02 М цистерн НС 1, нейтрализованныйдо рН 7,15 5%-ным раствором МаОН0 2 М 1-1-1 г0,1 М 11 С 1 г005 М 1-1 Сг0,025 М 1 С 1 г0,2 М .1 С 1 г в раствореТрис-буфера (рН 9,55)0,05 М 1 Сг в раствореТрис-буфера (рН 9,55)0,0125 М 1 Сг в раствореТрис-буфера (рН 9,55)Раствор трис-буфера (контрольныйдля данных по влиянию 11 С 1 г,+0,05 М Мд Сг в стерильной воде и0,1 моль/л ионов 1 а+0,2 М Мд С 1, в стерильной воде и0,1 моль/л ионов Ма+0,05 М Мд С 1 г в 0,0125%-ном растворетрис-буфера (рН 8,10) и 0,1 моль/лионов йа + Предлагаемый раствор лизата обладает высо.кой чувствительностью к зндотоксину. Формула изобретения,Раствор лизата на основе растворимых белков кровяных клеток1 ацца, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности к эндотоксину, он дополнительно содержит по крайнеи мере один компонент выбранный из следуницих групп: иогенное соединение магния, лития, стронция, бария, имидазола, цистеина в концентрации 0,005 - 0,3 моль/л раствора.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Вц 1 ет 1 п о 1 тте Рагептега 1 Огцд Аааосат 1 оп, го. 27, У 3, р, 39 - 148, 1973.