Способ получения монаколина, обладающего антигиперхолестеримическим действием

(Япония) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНАКОЛИНА К,ОБЛАДАЮЩЕ ГО АНТИГИПЕРХОЛЕСТЕ РИМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ общей формулыНО О заключающийся Мопазспз тцЬе выращивают в держащей исто и минеральные виях при 20-,3 левием целево ральной жидко 822)со- одаусло выде- ультуНО штамм Мопазсцз гцЬег 1005 (РЕВМ - Р 4822) выращивают в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, в азробных условиях при 20-35 ОС с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости.Способ получения манаколина К предусматривает использование штамма Мопавсцз гцЬег 1005. Штамм выделен из пищевых продуктов изготовленных в Таиланде в 1979 г.Штамм Мопазсцз.гцЬет 1005 хранится в коллекции Научно-исследовательского института проблем ферментации под регистрационным номером РЕКМи характеризуется следующимирально-морфологическими и физ биохимическими признаками.- Р 4822 культу"40 иолого Рост на картофельно-глюкозно-агаороной среде при 25 С быстрый и диаметр колонии достигает 6-6,5 см спустя 10 сут после инокуляции, Колония плоская и развивает относительно тонкий базальный слой гиф, Развитие воздушных гиф слабое; воздушные гифы белые и большинство из них опущены. 50 На базальном слое гиф образует множество клейстотеций и по мере созревания становится красновато-коричневым. Поверхность и нижняя сторона колонии по цвету от коричневой до 5 красновато-коричневой.Рост на агаровой среде С (ВаЬоцгацй) при 25 С очень 4 абуробыстрый Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового препарата,обладающего антигиперхолестеримическим действием. 5.Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено.Цель изобретения - создание способа получения монаколина К.Цель достигается тем, что согласно 10способу получения монаколина К,обладающего антигиперхолестеримическим двйствием, общей формулы и диаметр колонии достигает 6-6,5 смсмустя 10 сут после инокуляции. Поверхность колонии очень плоская ибазальные и воздушные гифы развиваются лучше, чем на картофельно-глюкозно-агаровой среде, Число клейстотеций весьма немногочисленно.,Поверх"ность колонии по цвету от красноватожелтой до красновато-коричневой,а обратная сторона - от красноватокоричневой до темно-коричневой.Рост на агаре на отваре из овсяноймуки при 25 С медленный и диаметрколонии достигает 1,5-2 см спустя10 сут после инокуляции. Колония плос-.кая. Развитие воздушных гиф и обра-.зование клейстотеций весьма слабоеПоверхность и обратная сторона колонии по цвету от темно-красной докрасновато-коричневой.Рост на среде Чапека при 25 Сочень медленный и диаметр колониидостигает 1,6-1,8 см спустя 10 сутпосле инокуляции.Скорости роста на каждой из приве"денных сред при 37 С по существуравны скоростям при 25 С.Клейстотеции сферические, диаметр30-60 мкм; стенки клейстотеций тонкие,и пленчатые; их ножки имеют чашелистиковые стенки и каждая состоит из.гифы диаметром 3,5-4,5 мкм и длиной15-80 мкм, Сумка состоит из восьмиопор и приблизительно сферическаяи быстро исчезающая. Аскоспоры бесцветны и имеют яйцеобразную илиовальную форму; размер 4-5 х 4-7 мкм;поверхности гладкие. Конидии бесцветные и сферические или грушеобраз.ные, размер 6-9 х 6-11 мкм; их основания плоские, стенки относительнотолстые и гладкие. Конидии связанывместе своими основаниями. Конидиеносцы подобны вегетативным гифами являются разветвленными или неразветвленными, причем конидии образованы на вершине. Мицелий бесцветныйи разветвленный и имеет чашелистиковые стенки; большинство из нихимеет диаметр 3-5 мкм,Способ осуществляют следующимобразом.Монаколин К может быть получен культивацией выбранного микроорганизма в культуральном бульоне в азробных условиях с применением известных методов для культивации гри бов и других микроорганизмов. Напри;11580 3мер, продуцирующий монаколин К микроорганизм может быть вначале культивирован на подходящей, среде, а затем полученные микроорганизмы могут быть собраны и использованы для инокуляции и культивированы на другой культуральной среде для нарабатывания требуемого монаколина К; культуральные среды, используемые для размножения микроорганизма и для 1 О нарабатывания минаколина К, могут быть идентичными или равными.Может использоваться любая извест ная культуральная среда, пригодная для культивации грибов, при условии, что она содержит необходимые питательные материалы, особенно источник усваиваемого углерода и источник усваиваемого азота. Примерами подходящих источников усваиваемого углерода являются глюкоза, мальтоза, декстрин, крахмал, лактоза, саха.роза и глицерин, из которых пред-. почтительны для производства монако- лина К глюкоза, глицерин и крахмал. д Примерами подходящих источников усваиваемого азота являются пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, соевая мука, арахисовая мука, жидкость после замачивания кукурузы, рисовые отруби и неорганические источники азота, из которых предпочтителен пептон. При производстве монаколина К неорганическая соль и/или соль металла могут быть,35 если это необходимо, добавлены к культуральной среде. Кроме того, если требуется, может быть добавлено небольшое количество тяжелого металла.Микроорганизм предпочтительно культивируют в аэробных условиях с использованием известных методов культивации, например, твердой культуры, встряхиваемой культуры или культуры в условиях аэрации и перемешивания. Микроорганизм растет в широком температурном диапазоне, например 7-40 С, но с точки зрения производства монаколина К более пред" почтительна температура культивации 20-30 С. 48 4тов. Культивация может быть затем продолжена до накопления в культу- ральной среде существенного количества монаколина К, после чего монаколин К может быть выделен и извлечен из культурального бульона с помощью любой подходящей комбинации методик выделения, выбранных с учетом его физических и.химических свойств. Например, возможно применение любого или всех нижеследующих методов выделе ния: экстракция раствора из культурального бульона гидрофильным растворителем (например, диэтиловым эфиром, этилацетатом, хлороформом или бензолом); экстракция организма гидрофильным растворителем (таким как ацетон или спирт); концентрирование; растворение в более полярном растворителе (например, ацетон или спирт); удаление примесей менее полярным растворителем (таким как петролейный эфир или гексан); гель-фильтрация через колонку с таким материалом как сефадекс; абсорбционная хроматография с использованием активированного угля или силикагеля, и т.п. Путем применения подходящей комбинации . этих методов требуемый монаколин К может быть выделен из культурального бульона в виде чистого вещества.Монаколин К, в том виде как он вы" делен из культурального бульона Мопазспз гпЪег штамм 1005, характеризуется следующими свойствами (серия А).Цвет и форма: бесцветные .кристаллыеЬТочка плавления: 157-159 С (с разложением).Элементарный анализ, 7: С 71,56; Н 8,85; О 19,59.Молекулярная масса: 404 (по данным масс-спектрометрии),Молекулярная Формула: С Н 6 О.УФ-спектр поглощения (метанол): максимумы на 232, 238 и 246 нм.ИК-спектр поглощения (КВ г).ЯМР-спектр (протонный 60 МГц; в дейтерированном хлороформе с использованием тетраметилсилина в качествевнутреннего стандарта).Во время культивации микроорганизма нарабатывание монаколина К может контролироваться отборомкультурной 55 среды и измерением физиологической активности монаколина К в культуральной среде с применением описанных тесЯМР-спектр (С; в дейтерированном метаноле). Растворимость: растворим в низшихспиртах (например, метаноле, этанолеи пропаноле), ацетоне, хлороформе, 1158048этилацетате и бензоле. Нерастворимв петролейном эфире и гексуне.Удельное вращениеф о 0,= + 307,6 (с=1, метанол).Тонкослойная хроматография 5КГ = 0,47 ГМф 5715 Кизельгель 60 Рсиликагель (фирма "Мерк энд Ко."),проявление смесью 4:1 метиленхлоридацетон, детектирование в виде УФ-поглощаемой массы, 50% (об,/об,) серная 1 Окислота (цвет от бледно-красного докрасновато-коричневого проявляетсяпри нагревании) или иодом.П р и м е р 1. Мопазспз гцЬегштамм 1005 инокулируют на жидкую 15культуральную среду, содержащую6 об.% глюкозы, 2,5 об,% пептона,0,5 об.% жидкости после замачиваниякукурузы и 0,5 .вес,/об,% хлоридааммония. Культивацию продолжают в Моаэробных условиях при 28 С в течение10 сут, Результирующий Фильтрат (5 л)культурального бульона доводят дорН 3 добавлением 6 н хлористоводородной кислоты, а затем экстрагируют Йравным объемом этилацетата, Растворитель из экстракта отгоняют припониженном давлении и результирующийостаток растворяют в 100 мл бензола.Нерастворимое вещество отфильтровы рвают.Фильтрат дважды промывают, каждыйраз 100 мл 5 вес,/об.% водным раствором бикарбоната натрия. Затем кпромытому Фильтрату добавляют 100 мл0,2 н водного раствора гидроокисинатрия и смесь перемешивают прикомнатной температуре. После подтверждения исчезнования монаколина К избензольного слоя данными ТСХ отделяютрводный слой. рН водного слоя затемдоводят до рНдобавлением 6 нхлористоводородной кислоты и результирующий раствор дважды зкстрагируют,каждый раз 100 мл этилацетата, Экстракт упаривают до сухого остатка припониженном давлении, получая 260 мгмасла.Монаколин К способен снижатьуровень содержания холестерина в 5 укрови и печени.П р и м е р 2. Снижение уровнясодержания холестерина в крови ипечени крыс.Используют крыс породы ВистарИмайити, каждая особь весом около300 г. Испытания проводят на групйахкрыс, каждая группа насчитывает по 5 животных, Каждому животному внутривенно делают инъекцию 300 мг/кг Тритона 112=1339 (товарное наименование для материала, повышающего уровень содержания холестерина в крови) при одновременном введении 10 мг/кг монаколина К либо перорально, либо внутрибрюшинно. Спустя 20 ч после перорального введения или 14 ч после внутрибрюшинного введения крыс умерщвляют путем обескровливания, кровь и печень собирают и обычными методами определяют уровень содержания холестерина в них. В результате установлено, что уровень содержания холестерина в крови ниже по сравнению с контрольной группой животных, которой вводят лишь Тритон Ж. на 22,4% в случае перорального введения и на 23,9% в случае внутрибрюшинного введения. Уровень содержания холесте". рина в печени снижен на 16,7% у животных, которым монаколин К вводят перорально., П р и м е р 3. Снижение уровня содержания холестерина в крови у кроликов.Используют подопытных животных - кроликов, имеющих вес тела 2,7 2;9 кг. Каждому кролику перорально вводят 1 мг/кг монаколина К дважды в сутки (утром и вечером) непрерывно в течение 5 сут, Перед введением и на третий и пятый день после введения собирают кровь из ушной вены и определяют содержание холестерина в сыворотке крови. В результате получено, что содержание холестерина на третий и пятый день после введения монако- лина К на 15 и 29% соответственно ниже уровня до введения минаколина К.Монаколин К обеспечивает 50%-ное ингибирование биосинтеза холестерина при концентрации 0,002 мкг/мл с помо- . щью эксперимента, в котором уксусную кислоту вводят в реакцию с ферментом из печени крыс. Обнаружено, что Мона- колин К ингибирует НМ С-СоА редуктазу, которая является регулирующим скорость Ферментом биосинтеза холестерина, и что он конкурентно ингибирует субстратную НМ С-СоА и имеет К, - значение, равное 5,3 х 10 М.К; - значение представляет собой константу ингибирования и, более конкретно, константу диссоциации комплекса Фермент-ингибитор. Зту величину получают умножением концентраций1158048 Составитель Г. СмирноваТехред М, Гергель Корректор И.Муска Редактор С. Лыкова Заказ 3961 Подписное Тираж 525 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 фермента и ингибитора с делениемна концентрацию комплекса ферментингибитор,В дополнение к высокоценному ингибиторному эффекту в отношении биосинтеза холестерина монаколин К характеризуется крайне низкой токсичностью, Так, острая пероральная токсичность (ЬЭо ) монаколина К для мышей составляет 1 г/кг веса телаили еще большую величину.Монаколин К может быть введенперорально или парэнтерально в виде 3 капсул, таблеток, препаратов дляинъекций или в виде любого другогоизвестного состава.Таким образом; получают препаратмонаколин К, обладающий антигипер 1 в холестеримическнм действием.