Способ выделения нуклеозид-5-монофосфорных кислот

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 09) 01)зад С 07 Н 1900 А МИТЕТ СССРИЙ И ОТКРЫТИЙ УДАРСТВЕННЫДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ы" М ЯЪЮ ЗЗЙ 43 1АНИЕ РЕТЕНИЯ ЛЬСТВУ К РСИОМ,К оти 5. Способ пю щ и й с я тем нозин-моно 15-кратный о ирование осущесб. Способ поющийсятеь уридин-монофо20-25-кратный о ирование,осущес(54) (57) 1. СПОСОБ ВЬДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-МОНОФОСФОРНЫХ КИСЛОТ из смеси, образующейся при фосфорилировании нуклеозидов галогенпроизводиыми фосфорных кислот в полярном органичес-. ком растворителе, путем нанесения на колонку, заполненную катионитом в Н -форме, с последующим элюироваФнием водой и выделением целевого продукта. упариванием элюата, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, .с целью упрощения процесса, реакционную смесь непосредственно после фосфорилирования наносят на 3-25- кратный объем сорбента, предварительно уравновешенного полярнымо растворителем, и элюируют при 1-20.2. Способ по п. 1, о т.л и ч а - ю щ и й с я. тем, что при выделении аденозин-монофосфата используют 3-5-кратный объем сорбента а элюир ванне осуществляют при 1-5 С.33. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при выделении инозин-монофосфата используют 5- 10-кратный объем .сорбента, а злюиро ванне осуществляют,при 10-15 С.о4. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что при выделении цитидин-монофосфата используют.1 О-кратный объем сорбента, а . злюирование осуществляют при 15- 20 С. п. 1, о т л и ч ачто при выделении фосфата используют бьем .сорбента, а элю твляют при 5-10 С.о п. 1.,отличачто при выделении сфата.используют бьем, сорбента, а элюо твляют при 15-20 С.1 129Изобретение относится к области химии, конкретно, к усовершенствованному способу получения нуклеозид"монофосфатов, используемых в производстве различных производных нуклеотидов для.научно- исследовательских работ в области молекулярной биологии и генетики.Нуклеозид-монофосфаты получают гидролизом рибонуклеиновой кислоты, О или химическим Фосфорилированием нуклеозидов с последующим выделением целевых продуктов хроматографическими методами.Наиболее перспективный из химических способов получения нуклеотидов является способ фосфорилирования галогенпроизводными фосфорных кислот, в среде, содержащей полярный органический растворитель Я и 2 . 20Реакционная смесь после Фосфорилирования нуклеозидов галогенпроизвсдными фосфорных кислот известными способами 11 и 2 содержит 1 в основном хлорангидрид нуклеозид-монофосфорной кислоты, непрореагировавший остаток нуклеозида, остаток Фосфори.-. лирующего агента и полярный органический растворительнапример, триалкилфосфат,ацетонитрил, пиридин).30Известен, например, способ выделения целевого продукта из данной реакционной смеси 1, заключающийся в том, что реакционную смесь после проведения синтеза гидролизуют водой и далее после нейтрализации разделяют полученные при этом продукты на колонке с анионитом в Формиатной Форме.Недостатками известного способа анионного обмена являются большие 40 объемы колонок с,анионитом.Кроме того, полученные растворы нуклеозид-монофосфорных кислот имеют очень высокую кислотность рМ 1), При такой кислотности выре 45 лять непосредственно нуклеозид- монофосфорные кислоты невозможно из-за их неустойчивости и повышенной растворимости в кислотах. Поэтому полученные растворы нейтрализуют и целевой продукт выделяют в виде соли.Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения нуклеозид 15-монофосфорных кислот из реакционной 5 смеси, образующейся в процессе фосфорилирования хлопроизводными фосфорных кислот 23 -0-защищенных нуклео 213 2эндов, в котором использовано свойство нуклеотидов существовать в катионной форме 3 .Согласно известному способу, реакционную смесь после.фосфорилирования гидролизуют водой. Образовавшуюся соляную кислоту удаляют в виде соли четвертичного амМониевого основания ( например, солянокислого пиридина).Фосфорную кислоту нейтрализуют раствором гидроокиси бария или лития и отфильтровывают в виде фосфата бария или лития.На колонке с катионитом в Н-формеразделяют затем 2 ,3 -0-защищенныйнуклеозид-монофосфат и соответствующий нуклеозид. На 1 объеь сорбента наносят 1 объем водного раство 1 /ра разделяемой смеси. 2 ,3-0-изопро-пилиден нуклеоэид-монофосфат элюируют водой. 2,3-0-Изопропилиден/нуклеозид-монофосфат затем самопроизвольно разлагается на нуклеозид-монофосфорную кислоту иацетон в течение 1-3 ч, рН полученного таким образом раствора воднымраствором щелочи доводят до 4.Раствор концентрируют нейтрализуют(рН 7) раствором щелочи. Образовавшуюся соль высаживают этанолом,отфильтровывают и сушат. Получаютсоли нуклеозид-монофосфорныхкислот с выходом 60-802.Полученные соли переводят в соответствующие кислоты, пропуская ихчерез колонку с катионИтом вН -Форме. Элюат упаривают в вакууме.Ф/Выходнуклеозид-монофосфорных кислот в известном способе составляет40-807,Недостатком известного способаявляется сложность процесса выделения, высокая кислотность элюата(рН ( 1 из которого целевые соедине)ния получают в виде солей. Свободные/нуклеоэид-монофосфорные кислотыизвестным способом можно получитьтолько путем повторного пропусканияводного раствора соответствующей соличерез колонку с катионитом в НФорме и упаривания полученного водного раствора,Цель изобретения - упрощениепроцесса.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу выделениянуклеозид-монофосфатов иэ смеси,образующейся при фосфорилированиинуклеозидов галогенпроизводными+Н форме, с последующим элюированиемводой и выделением целевого продук 5та упариванием элюата реакционнуюсмесь непосредственно после фосфорилирования наносят на колонку,заполненную 3-25-кратнымпо объемуколичеством катионита в Н -форме, 10предварительно уравновешенного полярным растворителем, колонку элюируютаводой при температуре 1-20 С. Нуклеоэид-монофосфорные кислоты выделяют иэ элюата упариванием.Ьыход составляет 80-907 в расчете на количество целевого продукта, получившеесяпри фосфорилировании.Существенным отличием предлагаемого способа является то, что непроизводят обработку реакционнойсмеси водой, что позволяет в однойстадии отделить целевые продукта как .от неорганических примесей, так и отнепрореагировавших исходных нуклеози 25дов,Поскольку элюентом являетсявода, на колонке происходит гидролизпродуктов, содержащихся в реакционной смеси, с выделением большогоколичества тепла. Чтобы снизитьскорость гидролиза и обеспечитьотвод выделяющегося тепла, колонкуохлаждают. Разделение проводятопри температуре 1-20 С. При температурах ниже +1. С в случае больших 35ообъемных соотношений в начальномучастке колонки при длительномпромывании может образоваться лед.При температурах выше оптимальныхрезко увеличивается кислотность 40элюата(следствие усиления гидролиза),что препятствует выделению нуклеозид-монофосфорных кислот.оптимальные температурные интервалы для конкретных соединений 45имеют следующие значения: С/Цитидин-монофосфат +15-+20Гуанозин-монофосфат +5-+1050Уридин-монофосфат +15-+20Кроме того, раствор целевогопродукта после элюирования имеетнезначительную кислотность(рН 2-4),что позволяет исключить нейтрализацию и получать свободные нуклеозид 5-монофосорные кислоты упариваниемнепосредственно элюата. Такая 213 4кислотность обеспечивается большим объемным избытком(3-25-кратным) сорбента по сравнению с ооъемом исходной смеси.Оптимальные 1 пля получения свободных нуклеозид-монофосфорных кислот объемные соотношения наносимой на колонку пробы.и сорбента установлены экспериментально. При соотношениях ниже оптимальных разделение компонентов (целевого продукта и галогенпроизводных фосфорных кислот недостаточно эффективно, практически, это выражается в том, что кислотность полученного раствора целевого продукта настолько высока, что из него невозможно выделить свободную1нуклеозид-монофосфорную кислоту без дополнительной. обработки. При использовании объемных соотношений выше оптимальных эффективность разделения достаточно высока, однако это не имеет смысла, так как неоправданно увеличивается объем элюанта и размер хроматографической установки.Получены следующие оптимальные соотношения между обьемами наноси,мой на колонку пробы и сорбента;г.Аденозин-монофосфат 1:3-1:5Инозин-монофосфат 1 в :5-1:10Цитидин-монофосфат 1:10-1:15иГуанозин-монофосфат 1-10-1:15ОУридин-монофосфат 1:20-1:25 Кроме того, улучшения качества разделения достигают путем уравновешивания сорбента перед нанесением реакционной смеси водой или полярным органическим растворителем.Таким образом, процесс выделенияднуклеозид-монофосфорных кислот согласно предлагаемому способу заключается в следующем. Колонну с оболочкой для охлаждения заполняют катионитом и уравновешивают полярным растворителем Горганическим или водой). Затем на колонку узкой зоной (объем наносимого1 1: раствора составляет в - -объема3 25 сорбента) наносят реакционную смесь непосредственно после фосфорилирования.1129213 О Колонку элюируют водой с температурой +10 С (при этом также охлаждают колонку через оболочку) и собирают вытекающий из колонки раствор.Первые 5-8 л раствора отбрасывают.Последующие 4-5 л раствора упаривают при пониженном давлении и целевой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают этиловымспиртом, Суспензию охлаждают доо3014 С и оставляют до полного оседанияосадка. Затем осадок фильтруют исушат.Получают 12,8 г гуанозин-моноФосфорной кислоты.моногидрата,Чистота.98%, Выход. 85%.3 р П р и м е р 3. Хроматографическуюколонку с оболочкой(размеры колонки:диаметр 4 см, высота 100 см) заполняют катионитом КУ.-2 в Н -форме. Объем.катионита в колонке 1000 мл. Колонкууравновешивают 1000 мл ацетонитрила.Затем на колонку наносят 100 млреакционной смеси, полученной, фосфорилированием 14,6 г инозина 21,6 млхлорокиси фосфора в 54 мл ацетонитрила 21,3 мл пиридина и 2,7 млводы, Реакционная смесь содержит18 .г инозин-монофосфата(определя.ют хроматографическим разделениемобразца с последующим измерениемБО количества целевого продукта спектрофотометрическим методом),Колонку элюируют водой с темпераотурой +15 С(при этом также охлаждакгтколонку через оболочку) и собираютвытекающий из колонки раствор,Первые 5-8 л раствора отбрасывают.Последующие 4-5 л раствора упариКолонку при включенном внешнемохлаждении промывают водой с температурой +1-+20 С и собирают вытекающий при этом из колонки раствор.Первая Фракция содержит частично.гидролизовавшийся .непрореагировавший Фосфорилирующий агент, растворенный в соответствующем полярномрастворителе(в органическом или вводе), Вторая Фракция содержитнуклеозид-монофосфаторную кислотурН этоой Фракций 2-4.Раствор нуклеозид-монофосфориой кислоты 1 яторая фракция) коицеитрируют и из концентрированного раст- .5вора выделяют целевой продукт,Получают препараты, содержащие96-98% основного вещества. Выходнуклеозид-монофосфорных кислотсоставляет 80-90% в расчете наколичество целевого продукта,образовавшегося в реакции фосфорилирования.Если необходимо получать солинуклеозид-монофосфорных кислот,то элюат, содержащий эту кислоту,перед упариванием, нейтрализуютщелочью.П р и м е р 1. Хроматографическуюколонку. с оболочкой (размеры колонки:диаметр,5 см, высотасм,заполняют катионитом КРСв Н - ФормеОбъем катионита в колонке 300 мл.Колонку уравновешивают 300 мл триметилфосфата. Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной Фосфорилированием 14,8 г аденозина 15,3 мл хлорокиси Фосфора в 80 мл , триметил- . Фосфата. Реакционная смесь содержит46,9 г аденозин-монофосфата (определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения) .Колонку элюируют водой с температурой +1 С(при этом также охлаждают колонку чрез оболочку) и собирают вытекающий при этом из колонки раствор.Первые 1-1,5 л раствора, содержащие хлорокись фосфора и триметилфосфат, отбрасывают.Последующие 2-2,5 л раствора ( содержит целевой продукт)упаривают при пониженном давлении до появления осадка. Суспензию, охлаждают и ос-тавляют до полного осаждения. Затем осадок фильтруют и сушат. Получают .16,3 г моногидратаИаденозин-монофосфорной кислоты. Чистота. 98%, Выход. 90%.П р и м е р 2. Хроматографическую колонку с оболочкой(размеры колонкие диаметр 4 см, высота 100 см) заполняют катионитом КРСв Н -форме. Объем катионита в колонке 1000 мл.Колонку уравновешивают водой.Затем на колонку наносят 100 мл реакционной смеси, полученной фосфорилированием 12,65 г натриевой соли гуанозина 12,5 мл хлорокиси фосфора в 85 мл триметилфосфата, Реакционная смесь содержит 14,1 гуанозин-монофосфата определяют разделением образца с последующим измерением кол-ва целевого продукта, спектрофотометрическим методом) вают при пониженном давлении и целе1129213 40 ВНИИПИ Заказ 9298/19 Тираж 380 Попписное Филчал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4 вой продукт из полученного концентрированного раствора осаждают этиловым спиртом. Суспензию .охлаждают до+4 С и оставляют до полного оседанияосадка. Затем осадок фильтруют и 5сушат,Получают 5,8 г инозин-монофосфорной кислоты.моногидрата. Чистота96. Выход 807,П р и м е р 4. Хроматографическую Околонку с оболочкой(размеры колонки:диаметр 4 см, высота 130 см) заполняют катионитом КУв Н -форме. Объем+катионита в колонке 1,5 л. Колонкууравновешивают водой, 5Затем на колонку наносят 100 млреакционной смеси, полученной фосфорилированием 17 г гуанозина 18 млпирофосфорилтетрахлоридом в 60 млацетонитрила и в присутствии 33 гсолянокислой соли пиридина. Реакционная смесь содержит 17 8 г гуанозин 1Ъ5-монофосфата(определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения) .Колонку элюируют водой с температурой +5 С 1,при этом также охлаждаютколонку через оболочку) . Собираютвытекающий иэ колонки раствор.Первые 7-10 л раствора отбрасываЗОПоследующие 6-8 л раствора нейтрализуют раствором едкого натрия илиофилизуют.Получают 19,2 г дигидрата динатриевой соли гуанозин-монофосфорной З 5кислоты. Чистота 967 Выход 853.П р и м е р 5. Хроматографическуюколонку с оболочкой(размеры колонки:диаметр 4 см, высота 130 см) заполняют катионитом КРСв Н -форме.+Объем катионита в колонке 1,5 л.Колонку уравновешивают водой,Затем на колонку. наносят 100 млреакционной смеси, полученной фосфорилированием 9 г цитидина 6,8 млхлорокиси фосфора в 92,5 мл триэтилфосфата. Реакционная смесь содержит10,5 г дигидин-монофосфата (определяют спектрофотометрическим методомпосле хроматографического разделения).50Колонку элюируют водой с температурой +20 С(при этом также охлаждают колонку через оболочку) . Собираютвытекающий из колонки раствор,Первые 7-10 г раствора отбрасывают.Последующие 8-10 лраствораупаривают при пониженном давлениидо появления осадка Суспензиюоохлаждают до +4 С и оставляют дополного оседания осадка. Затем осадок фильтруют и сушат.Получают 10,3 г моногидратацитидин-монофосфорной кислоты,Чистота 977 Выход 902.П р и м е р 6. Хроматографическуюколонку с оболочкой(размеры колонки:диаметр=5 см, высота 140 см)заполняют катионитом КУ, в Н -форме. Объем катионита в колонке 2,5 л, Колонку уравновешивают водой.Затем на колонку наносят 00 млреакционной смеси, полученнойфосфорилированием 15 г натриевойсоли уридина 15 мл хлорокиси фосфора 85 мл триметилфосфата. Реакционная смесь содержит 16,8 г уридин5-монофосфата(определяют спектрофотометрическим методом после хроматографического разделения) .Колонку элюируют водой с темперао,турои +20 С(при этом также охлаждаютколонку через оболочку)и собираютвытекающий из колонки раствор.Первые 3-5 л раствора отбрасывают.Последующие 3-5 л раствора нейтрализуют раствором едкого натра иупаривают при пониженном давлении.Целевой продукт из полученного концентрированного раствора осаждаютацетоном. Суспензию охлаждают доо+4 С и оставляют до полного оседания осадка. Затем осадок фильтруюти сушат.Получают 17,5 г дигидрата динатриЭ (евой соли уридин-монофосфорнойкислоты. Чистота. 962. Выход. 803,Таким образом., предлагаемый способ позволяет упростить процесс/выделения нуклеозид-монофосфорныхкислот, исключив стадии гидролиза,отделения неорганических примесей,нейтрализацию элюата и выделениясвободных кислот из их солей, присохранении высокого выхода и чистоты целевых продуктов.