Способ определения госсипола в биологических материалах

(54)(57) 1, СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОССЕПОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ,включающий экстракцию свободного госсипола из анализируемой пробы, отделение твердой фазы, гидролиз ее в присутствии анилина для выделения связанного госсипола, последующую очистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителя иидентификацию госсипола в полученныхфракциях экстракта и гидролизата поцветной реакции с хлорным железом,отличающийся тем, что,с целью повышения чувствительностиспособа, перед идентификацией госсипола полученные фракции подвергаютдополнительной очистке хроматографированием в тонком слое силикагеля,2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов хлопковых семян, жмыха, шротов и комбикормов дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстракта, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10 т 1:8+1:8+1.3. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что при использовании в качестве биологических материалов тканей животных дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из экстрактов, осуществляют в две стадии, причем первую стадию проводятв присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир, толуол, ацетон и хлороформ в соотношении 1011:2+1:4+1:4+1, а вторую - в присутствии смеси растворителей, содержащей уксусную кислоту, толуол и гексан в соотношении 10+1:8+1:8+14, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что дополнительную очистку хроматографированием фракций, полученных из гидролизата, осуществляют в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир и ацетон в соотношении 1511:10+1.1 11268Изобретение Относится к.способам опрсделения госсипола ( 2 р 2-дирбр 7." -тркокси-изопропил-альдегидокяфтил) в семенах хлопка, его жмыхяхр шротах, а также комбикормах и тканях животных для контроля зя его содержанием прк производстве кормов ипри диагностике токсикозовИзвестен способ определения госсипола в хлопковых семенах, жмыхе и ошротах р включающий экстракцию свободного госсипола Диэткловым эфиРомрконцентрацию экстракта, реакцию госсиг.пола с акилином и пиридином к поспздутощее определение его количества ве- ,совым методом. Связанный госскполопределяют после экстракции свободного в той же пробе путем гидролизав присутствии акилина и последующеговзвешивания госсипола1 3Известен таОке способ определениягоссипола В органах и тканях животныхр включаюшкй извлечение Р"вобоДногогоссипола органическими растворителями, реакцито с янилином после последо вательной обработки экстракта растворителями к последующее Определениегоссиполя по цветной реакции Опрегделение связанного госсиполя проводятпутем гидролиза его в присуттвиианклина после извлечения свободногогоссиполя в той же навеске и последующей экстракции связанного госсипола гексаном 1 2 1.Однако известные способы определе,ния госсипола недостаточно чувствительны,Цель изобретения - повышение чувствительности способа определения госсипола. Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения госсипола в биолотических материалах,.вклточающему экстракцию свободногогоссипола из анализируемой пробы, отделение твердой Фазы, гидролиз ее Вприсутствии акилина для выделениясвязанного госсипола, последующуюочистку экстракта и гидролизата последовательной обработкой растворителями к идентификацию госсиполя в полученньгх фракциях экстракта и гидролизата по цветной реакции с хлорнымжелезом, перед идентификацией госскгпола полученные фракции подвергаютдополнительной очистке путем хроматографировяния .в тонком слое силтикягеля,72При использовании в качестве биологических материалов хлопковых семяк. жмыха, гротов к комбикормов дополнительную очистку хроматографировакием фракций, полученных из экстракта, Осушествлтпот в присутствии смеси растворителей, содержащей уксуснуо кислоту, толуол и гексан в соотноптеник 10+1;811;8+1При использовании в качестве биологических материалов тканей жкзотных дополнительную очистку хроматографкрованием фракций, полученныхиз экстрактов. осуществляют в двестадии прием первую с-адию проводят в присутствии смеси растворителей, содержащей петролейный эфир,толуол, ацетон и хлороФорм в соотношении 1 О.К 1:2+1:,4+1:4+1 р а вторую - вприсутствии смеси рястворктехЯйр соДеРжашеи УксУснУто ккслотУр толУсл игексан в соотношении 10+1:8+1:8+1Дополн 1 телькуто Очистку хроматографировянием фракций; полученных. КзГКЦР ОЛК З Ят а р О СУЩЕ Ст тЗЛЯ Ют В ПРИ СУт Ствки смеси растворителей; содержащейпетролейный эфир и ацетон в соотношении 15+,;101,П р и 11 е р 1. Спределе:1 ке госсиПОЛЯ В ХЛОПКОВЫХ СЕМЕНЯХ, ШРОтаХржмыхе к комбикормах,А. Массу исследуемого Образца измельчают НЯ мельнице до порошкообразного состОЯнивр тшательно пеРемешивают и отбирают среднюю пробу семян,шрота, жмьНЯ 2-3 г, комбикормов 5 г.Образцы помещают в колбу объемом250 мч, добавлятот 50 мг смеси а 1 тетона и зоцы 7:3и 5-6 стеклянных бусинок, После "0 мин перемешивянияэкстракт профкльтровывают через бумяжньй ооильтрр колбу три раза промывают той же смесью,. Фильтрят и смывы.10 меЩЯЮТ Б Делител 1 рнУЮ ВОРОнкУ р вно сят туда 10 мл петролейного эфира и тщательно переметткваютПосле разделения слоев нижний, содержащий госсипол, сливают в другую делительную воронку, а верхний слой эфира отбрасьтвают, Обработку петролейный эфиром повторяют, после чего В воронку вносят 100 мп ДксткллкрОВЯнкок ВОДЫ и 1 ттт концентркрОВянкОЙ соляной кислоты, перемешивают и гровоцят Обработку экстракта хлороформом. Хлороформ добавляют порциями 5-6 раз по 5 мл, Осъедкненные хлороформньте экстракты Объединяют к Выпаривают досухя В ТО ке воздуха, Сухие Остатки кз проб1126872семян, жмь.,а и шротов растворяют в10 мл, а из пробы комбикорма в 2 мл ацетона.Полученные Фракции экстракта наносят на пластину "Силуфол" 11020 мкл экстракта из образцов семян, жмыха и шротов и 50 мкл экстракта из образцов комбикорма ). Хроматографирование проводят в присутствии хроматографической смеси: ледяная уксус Оная кислота - толуол - гексан в соотношении 11:9;9 или 9 7:7, Послетого, как Фронт растворителей проходит 10 см. пластину вынимают из камеры, просушиваюти опрыскивают 155%-ным раствором хлорного железа в50%-ном этаноле. В 1 госсипола составил в первом случае 0,8, во втором0,85;. пятна округлые, оливко-серогоцвета на желтом фоне. 20Б. Для освобождения связанногогоссипола в колбы с остатками материала после извлечения свободного госсипола твердая фаза ) добавляют 10 мл ацетона в пробы семян, жмыха и шротов 25 или 10 мл 72%-ного этилового спирта в пробы комбикорма и 1 мл свежеперегнанного анилина. Колбы закрывают и помещают на 30 мин в водяную баню1,температура 60-70 С ), после чего охлаждают. К полученным гидролизатам добавляют 50 мл гексана, выдерживают при встряхивании 30 мин, а затем гексановые фракции гидролизатов в дели- тельных воронках 5-6 раз по 5 мл35 промывают 0,2 н. раствором соляной кислоты. После разделения слоев гексановые фракции гидролизатов высушивают досуха в токе воздуха. Сухой остаток растворяют в О мл (пробы из 40 семян, жмыха и шротов ) или в 2 мл ацетона (пробы из комбикормов ) и наносят на пластины "Силуфол" по 20 или 50 мкл соответственно, параллельно наносят стандартный раствор дианилингоссипола.45Хроматографирование проводили в при-. сутствии смеси растворителей: петролейный эфир - ацетон в соотношении14:9 или 16:11.После того, как фронт растворителей проходит 1 О см, пластины подсушивают и проявляют 5%-ным раствором хлорного железа в 50%-ном этаноле.Пятна округлые, коричневого цвета, 55 ВГ впервом случае 0,6,во втором 0,55.,П р и м е р 2, Определение госси- пола в образцах мышц, почек, печени. Чувствительность предложенного способа определения госсипола для определения свободного госсипола в кормах составляет 0,15 мг/кг, в тканях животных 0,02-0,05 мг/кг, связанного во всех субстратах 0,05 мг/кг. Абсолютная чувствительность обнару,жения стандартного вещества в тонком слое силикагеля составляет: свободТаблица 1 Обнаружено, Е Внесено впробу, мкг Ис следуемыйобъект Иэвестнык способ Предложенный способ Свободный Связан"ный Свободный Связанный 1.Хлопковыйшрот 0,18 Без добавки 0,020,020,022 023 0,03 0,032 0,032 0,25 О, 16 О,23 0,02+0,0008 0,14+0,02 0,031+0,0 0,24+0 2. Хлопковыйшрот О, 025 О, 025 0,025 0,025 0,21 0,1 0,2 0,0123 0,01231 0,00004 О, 12+0,01 0,210,0 3.Хлопковььшрот 0,0123 Не ис- О, 03 следо- валось 100 Не иссле довало сь 0,06 0,0124 0,0123 750 1000 0,075 Таблица 2 Обнаружено, мкг Количество внесенного Госснпола,мкг Исследуемыйсубстрат НавесСвобод- Связанный ный Свободный Связанный ка, г 7,0 70 1 О Мышцы Мышцы 80 30 3 112687 ный госсипол 0,03-0,01 мкг, связанный О, 1 мкг. Степень определения свободного госсипола составляет 70-80 Х, связанного 1007Более высокая чувствительность 5 предложенного способа определения госсипола в хлопковых шротац.посравнению с известным способом (ГОСТ 13979.11-69) пьказана в табл.1 определение госсипола в хлопковых 10 шротах ).В табл. 2 представлены результаты определения госсипола в тканях животных согласно предложенному способу, 15 Без добавки 0,0124Таким образом, предложенный способ определения госсипола обладаетвысокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать его в любых субстратах и в самых небольших количествах,а зто, в свою очередь, позволяет гарантировать профилактику токсикозов,вызванных госсиполом.Кроме того, предложенный способопределения госсипола прост в исполнении, для проведения анализа нетребуется сложное оборудование, авремя проведения анализа по сравнениюс известным способом значительносокращается,Степень определения,7.8 1126872 Продолжение табл,3 наружено,мкг Степень определения,Х Количество внесенИсследуе субстрат авесг ного госсипола,мк Иыш 0 сч ах свободный г ак связанный г определяли,нпо лич ных сипол его,следо КуриленкоКоцюбняк Корректс Составитель Редактор С.Тимохина ТехреЗаказ 8684/ Тираж 822 Государственно лам изобретен осква, Ж, РПодписноекомитета СССРи отк тий ВНИИПИгопо де ий рь113035, И аушская наб д. 4/5 Патент", г. Ужгоро Филиал ектная,чень чень 100 200 7,025,6 Связан Свобод- Связанный ный ный 8110200