Способ получения фактора уш: с свертывания крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ИВЯО 35/14 4 А ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПАТЕНТ(54) СПОСОБ СВЕРТЫВАНИЯ (57) Изобре выделения п крови. Цель ПОЛУЧЕНИЯКРОВИ АКТОРА УШ ение предназначено дляепаратов свертыванияизобретения - увеличен;Ь ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 56) Вдапт. В 1 орйуз, Асйа, 1981,о 1. 668, р. 456-470. выхода целевого продукта, Плазму подвергают адсорбции с применением двухводонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров в присутствии гепарина. Смола А - сополимер этиленаи малеинового ангидрида, сшитый сметилиминобиспропиламином, содержащий концевые диметиламинопропилимидные группы. Смола Б - сополимер этилена и малеинового ангидрида, сшитыйс диметиламинопропилимпдом, В смоле Бвсе свободные карбоксильные группызащищены метоксипропиламином. Послеобработки плазмы крови смолами А и Бполучают фильтрат, который концентрируют и частично обессоливают, пропуская через полупроницаемые мембраны. 2 табл.Изобретение относится к медицине,в частности к области фракционирования крови и выделения препаратовсвертывания крови.Цель изобретения - увеличение5выхода целевого продукта - фактораУШ:С.Цель достигается за счет Функционирования плазмы крови при определенных значениях рН с использованиемдвух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров, применяемых в присутствии экзогенного гепарина. 15Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Кровь человекапереливают в пластмассовые мешочки,содержащие противосвертывающее вещество - СРЭА(цитратное, фосфатное, декстразовое противосвертывающее вещество с адепином - антикоагулянт-США). Отделяют плазму центрифугированием при силе 500-4000 я в 25течение 4 ч, при 20-24 С. Порцииплазмы по 200 мл замораживают при-2 О С.Самозамороженную плазму подвергают .адсорбции при комнатной температуре 30с применением двух водонерастворимыхсшитых полиэлектролитных сополимеров(смол) в присутствии экзогенногогепарина. Смола А - сополимер эквимолярных количеств этилена и малеинового ангидрида, сшитый с 5 мол.7. метилиминобиспропиламина, содержащий90 мол.7 О концевых диметиламинопропилимидных групп. Смола Б - сополимерэтилена и малеинового ангидрида, 40сшитый с 5 мол.7 диметиламинопропилимида, содержащий 5 мол,7 концевыхдиметиламинопропилдиимидиых групп.В смоле Б все свободные карбоксильные и ангидридные группы защищены метоксипропиламином,До применения смолу Б предварительно обрабатывают следующимобразом,12 г смолы диспергируют в 200 мл 0,154 М МаС 1, содержащего 0,17 альбу- мина сыворотки крови крупного рогатого скота (АСК). С помощью 1,0 М лимонной кислоты устанавливают рН 4,0. Диспергирование проводят в 55 течение 3-5 мин при перемешивании, Суспензию отфильтровывают, фильтрат отбрасывают. Получают влажную смоляную фильтр-прессную лепешку, которую вновь диспергируют в 200 млИаС 1/АСК. Добавляя при перемешивании1,0 М ИаОН, устанавливают рН 5,8.Перемешивание продолжают еще 10 мин.Суспензию отфильтровывают, а влажнуюлепешку используют для последующегоФракционирования,Все растворы, используемые приэлюировании и в процессе фракционирования содержат 0,17 АСК.Натриевую соль свиного гепаринаиспользуют в виде раствора "200 ед/млв физиологическом растворе.Процесс фракционирования осуществляютследующим образом.Один мешочек (т.е. 200 мл) свежезамороженной плазмы быстро оттаивают.,помещая его в перемешиваемую водян-;ьобаню при 37 С, Затем добавляют всмесь 1 мл раствора гепарина (т.е.200 ед), перемешивают смесь 3-5 мин,Отбирают пробу для проведения испытания на коагуляцию (регистрируютобъем и время). Контрольные пробыидентичны испытуемым, однако бездобавления гепарина в плазме.К плазме добавляют 70 мг смолы А,значение рН доводят до 8,0 с помощь.1 М ИаОН, выдерживая это значениерН при перемешивании смеси в течение120 мин. Затем смесь Фильтруют,полученный Фильтрат содержит большуючасть активности Фактора УШ:С.Мокрую смоляную лепешку промывают20 мл дистиллированной воды, перемешивают 5 мин, фильтруют и два полученных фильтрата собирают и испытывают на фактор УШ;С. Регистрируютобъем активности для подсчета общегоколичества единиц коагулирования.К фильтрату добавляют предварительно обработанную смолу Б (12 г),добавкой 1 М лимонной кислоты доводят рН до 5,8 и суспензию перемешивают 20 мин, выдерживая рН 5,8. Сус=пензию отфильтровывают, осадок промывают 200 мл 0,002 М БаС 1. Затемосадок диспергируют в 200 мл 0,3 МИаС 1, устанавливают рН 5,8, суспензию перемешивают 5 мин, снова Фильтруют, промывают осадок дополнительными 200 мл 0,3 М ИаС 1, а фильтратотбрасывают.фильтрованный осадок вновь диспергируют в 200 мл растворителя для элюирования, содержащего 1,5 М ИаС 1, 01 М лизин и 0,17 АСК. Устанавливают рН 6,0 и перемешивают суспензию1375116 Таблица 1 авки г 76 137 20,5 53,20 мин. Суспензию отфильтровываюти осадок промывают 20 мл растворителя элюирования, после чего отбирают пробу Фильтрата для испытанияна коагуляцию, как указано в табл, 1фильтраты, содержащие 40-702первоначальной свертывающей активности Фактора УШ:С в очищенном виде,концентрируют и частично обессоливают, пропуская через полупроницаемыемембраны (М 1111 роге Ре 111 соп СаззегСе Г 11 ггагхоп зузгеш или АшасопВН 4 Ьо 11 оът 21 Ьег сопсепгагог зузгеш). 15Концентрированный раствор сушатвымораживанием и упаковывают дляих хранения,В табл. 1 приведены результатынескольких проходов фракционированияс использованием собранной плазмыстабилизированной СРДА, иллюстрирующие благоприятное действие добавления гепарина к плазме в сочетаниис использованием смол А и В. 25Определение Фактора УШ:С осуществляют путем индикации начала процесса свертывания, Измеряют вторую произ-.водную скорости коагулирования (т.е.скорости изменения скорости коагулирования). В качестве контроля используют плазму, в которой отсутствуетФактор УШ:С, при этом в качествеактиватора используют эллаговуюкислоту.Определяют время коагулированияна серийных разбавлениях используемых фракционированных проб, Полученные результаты выражают как процентвыделения активности фактора УШ:С,считая на степень активности первоначально собранной пробы плазмы.Первоначальная проба считается содержащей 1 ед активности коагулирования Контрольные пробы бе фактора УШ:С на 1 мл. Каждое из испытаний начинали с общего количества200 ед коагулирования. Наконец регистрируют кумулированную единицу ипроцент выделения активности послекаждой обработки смолой. П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1, эа тем исключением, что к исходной плазме до обработки смолой А и к Фильтрату до обработки смолой Б добавляют три разные концентрации гепарина,Результаты представлены в табл. 2. формула изобретения Способ получения фактора УШ:С свертывания крови путем фракционирования его из крови адсорбцией на водонерастворимом сшитом полиэлектролитном сополимере с последующим элюированием целевого продукта с адсорбента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, плазму крови при рН 8,0 смешивают с 0,035 мас.7 сопо" лимера этилена и малеинового ангидрида, сшитого в присутствии 0,1- 1,0 ИЕ/мл гепарина с 5 мол,Е метили-., минбисопропиламина, содержащего 90 мол,Е концевых диметиламинопропилимидных групп, с последующим отделением супернатанта, в который при рН 5,8 добавляют 6 Ж сополимера этилена и малеинового ангидрида, сшитого с 5 мол.Ж метилиминобиспропиламина, содержащего 5 мол.Е концевых диметиламинопропилимидных групп, при этом свободные карбоксильные и ангидридные группы блокируют добавлением метоксипропиламином в присутствии 0,1- 1,0 МЕ/мл гепарина.Заказ 622/57 Тираж 655 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5+иВ пересчете на активность первоначальнои плазмы. 1 1 46,5 38,2+10,4