Способ получения низших -аминокислот

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 с е ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Дегусса АГ (ФРГ) и Гезельшафтфюр биотехнологише форшунг мбХ (ГБФ)(54)(57) СПОСОБ НОЛУЧЕНИЯ НИЗШИХо(-(=АМИНОКИСЛОТ из соответствующихнизших о(.-кетокислот в присутствииспецифической по отношению к субстрату дегидрогеназы,. соли аммонияи никотинамидадениндинуклеотида(НАД+/НАДН) при одновременной реге,.801069622 А 3(50 С 07 С 101/04//С 07 В 29/О С 12 Р 13/64 нерации НАДН из НАД о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в реактор с мембранойдля ультрафильтрации, средний размерпор которой равен 1-3 мкм, помещаютраствор форйиагдегидрогеназы и специ.фической по отношению к исходнойнизшей о -кетокислоте дегидрогеназы, содержащий НАД+/НАДН в концентрации 3,55-3,92 ммоль/л, которыйсвязан с полиэтиленгликолем со сред"ним молекулярным весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходнойо(;кетокислоты в виде водорастворимойсоли и водный раствор формиата аммония в качестве соли аммония концент"рацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе стороны мембра.ны подцерживают 0,2-0,5 бар, и непре.рывно отводят из реактора через мембрану. поток Фильтрата, содержащийцелевой продукт.Изобретение относится к усовершествованию 1 ф получения низших с аминокислот, использующихся в фармакологии, пищевой промышленности, а также в качестве исходных соединений в пептидном синтезе.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения низших0-1,-аминокислот, заключающийся в том,что исходную соответствующую е -кето, кислоту вводят во взаимодействие со. специфической к субстрату дегидрогеназной в присутствии 0,1 М водногораствора соли аммония (например, двузамещенного фосфата аммония), никотинамидаденидинуклеотида (НАД+/НАДН) 15 при одновременной регенерации НАДН из НАД + с помощью метанола, этанола или этоксйэтанола в присутствии алкогольдегидрогеназы. При этом концентрация никотинамидаденин динуклеотида составляет приблизитель"но 1 ммоль/л, концентрация исходной,К-кетокислоты 10 ммоль/л, выходы целевых продуктов 4,4-93,1 Ъ (без учета .стадии их отделения от никотинамидадениндинуклеотида, ферментов и фосфата аммония) (1).Недостатком известного способа является сложность проведения процесса, связанная с необходимостью отде- Зления целевых продуктов от никотинамидадениндинуклеотида, дегидрогена-,зы кетокислоты и алкогольдегидрогеназы, В результате этого указанныеФерменты инактивируются, а никотинамидадениндинуклеотид может частично разрушаться, что делает практически невозможным повторное использование укаэанных компонентов,Целью изобретения является упроще-ние процесса знзиматического получения низших Ю аминокислот из соот-ветствующих низших о(.-кетокислот,Указанная цель достигается способом получения низших Ы.-(.-аминокислот иэ соответствующих низших Ы-кетокислот, заключающимся в том,что в реактор с мембраной для ультрафильтрации, средний размер пор кото"рой равен 1-3 мкм помещают раствор формиатдегидрогенаэы и специфической по отношению к исходной низшей о(-кетокислоте дегидрогеназы, содержащий НАД+/НАДН в концентрации 3,553,92 ммоль/л, который связан с полиэтиленгликолем. со средним мол-,весом 10 000, непрерывно подают водный раствор, содержащий 100-500 ммоль/л исходной с( -кетокислоты в виде водо- растворимой соли, и водный раствор .формиата аммония в качестве соли ам мония концентрацией 400-800 ммоль/л, причем разность давления по обе сто" роны мембраны подцерживают в пределах 0,2-0,5 бар и непрерывно отводят иэ реактора червэ мембрану поток 65 фильтрата, содержащий целево).продукт.Как правило, соотношение междуактивностями формиатдегидрогеназыи специфической по отношению к субстрату дегидрогеназы находится в интервале 1:(1-5) .Как йравило, имаобилизацию никотинамиддинуклеотида на полиэтилен-,гликсле проводят обработкой кофермента этиленимином с последующей концентрацией полученного Фаминоэтильного производного с карбоксилироваи-,ным полиэтиленгликояем с помощью водорастворимого карбодиимида, послечего иммобилизованнЫй продукт восстанавливают до соответствующего производного." НАДЯ, превращают, перегруппировкой по Димроту в И-производное и, в случае необходимости,окисляют до соответствующего производного НАД+ При этом концентрациякоэнзима обычно составляет О, 1 -10 ммоль/л, предпочтительно 17 ммоль/л,Концентрация формиата аммонияпредпочтительно должна быть равнойконцентрации исходной -кетокислотыили, по крайней мере, не ниже последней.Величину рН реакционной смЕси прнпроведении процесса обычно поддерживают в интервале 5-9.Как правило, целевые продукты выделяют известными способами, например, с помощью анионообменных смол.Осуществление предлагаемого способа дает упрощение процесса получения низших д,-(,-аминокислот из соответствующих низших о-кетокислот изаключается в более простом отделении целевых продуктов от исходных,например с помощью анионобменныхсмол; в воэйожности неоднократногоповторного использования дорогостоящих компонентов - формиатдегидрогеназы специфической по отношению кисходной о-кетокислоте дегидрогеназы, никотинамидадениндинуклеотидав непрерывности проведения процесса; в меньшем объеме. реакционнойсмеси (за счет увеличения концентраций) .П р и м е р 1. Термостатируемыйпри 40 С реактор объемом 10 мл сплоской мембраной, снабженный магнитной мешалкой и Мембраной для ультраФильтрации диаметром 62 мм с номинальным пределом исключения 3000(фирма-поставщик фЬмиконф, Виттен,тип ДМ 5) промывают для стерилизацииводным раствором формальдегида прискорости подачи 20 мп/ч с применением дозирующего. насоса, в течение при.мерно 5 ч. Затем в течение еще примерно 5 ч раствор формальдегида вытесняют дистиллированной водой. После этого также при скорости подачи20 мл/ч в течение примерно 2,5 ч1069622 пропускают профильтрованный черезстерильный Фильтр (0,2 мкм) растворсубстрата, содержащий 500 ммоль/лнатриевой соли пировиноградной кислоты, 400 ммоль/л и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия и доведенный до рН 8 при помощи гидратаокиси натрия. После этого вместораствора. субстрата подают. 10 мл раствора никотинамидадениндинуклеотида,содержащего 3,66 ммоль/л НАД+, свя- .ц)эанного с полиэтиленгликолем со средним мол. весом 10 000 и 50 ммоль/лфосфатного буферногораствора для установления рН на уровне 8. Послеэтого снова подают раствор субстра. та этого же состава со скоростью20 мя/ч.Затем в реакционное пространствоперед мембраной через боковое отверстие вводят 100 мг формиатдегидрогенаэы .(активность 6,74 мкмоль/мг в минуту при Формнате в качестве субстрата,. 40 С и рН 8) в форме водного глицеринового раствора 50 повесуглицерина), 10 мг формиатдегидроге-.назы/мл) и 1,62 мд Ь-аланиндегидрогеназы (активность 415 мкмоль/мг вминуту при пирувате в качестве субстрата, 40 С и рН 8) в Форме водного раствора в сульфате аммония(2,4 моль/л сульфата аммония, 5 мгЬ-аланиндегидрогеназы/мл) при помощишприца. При таком. составе соотношение между активностями формиатдегидрогеназы и Ь-аланиндегидрогеназы составляет 11, За процессом превращения 35 непрерывно следят при помощи вмонти. рованной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра. Дифференциальное давление у мембраны достигает вначале 0,2 бар, затем постепенно повыша ется.до 0,5 бар н остается после этого постоянным. В течЕние рабочего периода, составляющего примерно 50 ч, получают 175 ммоль Ь-аланина. Максимальная скорость превращения достигает 6,45 имоль Ь-аланина/ч.Получают 108 ммоль Ь-аланина из расчета на 1 мг Ь-аланиндегидрогенаэы или 1,75 ммоль Ь-аланина из расчета на 1 мг Формиатдегидрогенаэы. Выход целевого продукта 35, оптическая чистота 100. но.профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 800 ммоль/л формиата аммония и 50 ммоль/л однозамещенного фосфата натрия и установ-. ленный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместо раствора субстрата при скоростиподачи 4 мл/ч вводят смесь иэ 10 мп раствора коэнзима (в соответствии с примером 1) и 85 мг Формиатдегидрогеназы (активность 0,85 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в форме водного глицеринового раствора 50 по весу глицерина), 10 мг формиатдегидро" геназы/мп). После этого в реакционное пространство через боковое отверстие вводят при помощи шприца0;94 мг .Ь-аланиндегидрогенаэы (активность 233 мкмоль/мг в минуту пори пирувате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в Форме водного раствора сульфата аммония (2,4 моль/л сульфа. та аммония, 5 мг Ь-аланиндегидроге назы/мл) . Соотношение между активностями достигает 1:2,2. В течение П р и м е р 2. Стерилизацию мембранного реактора объемом 10 мл с плоской мембраной (мембрана с номинальным пределом исключения 5000, Фирма-поставщик ффАмикон, Виттен, тип УМ 5), поддерживаемого при 25 фС проводят таким же способом,У.60 как и в примере 1.При скорости подачи 20 мп/ч, и течение примерно 25 ч подают стерильно профильтрованный раствор, содержащий 400 ммоль/л натриевой соли пировиноградной кислоты, 400 ммоль/л фор-б 5 миата аммония и 50 ммоль/л одноэамещенного,фосфата натрия и установлен- .ный на уровне рН 8 при помощи гидрата окиси натрия. После этого вместораствора субстрата при скорости подачи 4 мл/ч подают смесь из 7 мл раствора коэнзима (в соответствии с примером 1) и 138 мг Формиатдегидрогенаэы. (активность 0,85, мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата,. 25 ОС и, рН 8) в форме водногоглицеринового раствора 50 по весуглицерина), 10 мг формиатдегидрогеназы/мл). После этого в реакционноепространство через боковое отверстие вводят 2,78 мг Ь-аланиндегидрогеназы(активность 233 мкмоль/мг в минуту при пирувате в качестве субстрата, 25 С и рН 8) в форме водного раствора в сульфате аммония (2,4 моль/лсульфата аммония, 5 мг Ь-аланиндегидрогеназы/мл) при помощи шприца. Соотношение между активностями формиатдегидрогеназы и Ь"аланиндегидрогеназыдостигает 1:4. В течение 59 ч получа.ют 48 ммоль Ь-аланина, что собтветствует 17,3 ммоль Ь-аланина из расчетана 1 мг Ь-аланиндегидрогеназы или0,35 ммоль Ь-аланина из расчета на1 мг формиатдегидрогеназы. Выход целевого продукта 10,2, оптическаячистота 100,П р и м е р 3, Стерилизацию реактора объемом 10 мл с плоской мембраной (мембрана с номинальным пределомисключения 5000, фирма-поставщикАмикон, Виттея, тнп УМ 5), термостатируемого при 25 ОС, проводят,как описано в примере 1.При скорости подачи 20 мл/ч, в течение примерно 2,5 ч подают стериль"140 ч получают 92 ммоль Ь-аланина,что соответствует 98 ммоль Ь-аланина из расчета на 1 мг Б-аланиндегид-рогеназы или 1,08 ммоль Ь-аланинаиз расчета на 1 мг Формиатдегидрогеназы. Выход целевого продукта составляет 8,2, оптическая чистота 100.П р и м е р 4, Термостатируемыйпри 25 С реактор объемом 11,3 мл сплоской мембраной, который снабженмагнитной мешалкой и ультрафильтрационной мембраной диаметром 62 мм сноминальной границей исключеиия5000 (Фирма-поставщик фАмикон,виттен, тип УМ 5), промывают длястерилизации с помощью установленного на скорость подачи 20 мл/ч дозирующего насоса примерно в течение5 ч водным 70-ным раствором этилоного спирта вытесняют дистиллированной водой. После этого также со окоростью подачи 20 мл/ч примерно в течение 5 ч подают профильтрованный через стерильный фильтр (0,2 ммк) раствор субстрата, который содержит100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо4-метилпентановой кислоты и400 ммоль/л Формиата аммония, и с помощью раствора едкого натра устанавливают рН 8. Затем в ток субстратамежду дозирующим субстрат насосом и 30стерильным Фильтром подают дозированно 11,77 мл, соответственно 35,2 мгФормиатдегидрогеназы (активность4,06 мк моль/мг в минуту в случаеФормиата в качестве субстрата, при25 С и рН 8) в форме водного полиэтиленгликолевого раствора (40 вес.этиленгликоля со средней мол, массой 400; 3 мг формиатдегидрогеназы/мл),40Дополнительно аналогичным образом дозируют 1,6 мл, соответственно,6,72 мг лейциндегидрогеназы (активность 10,46 мк моль/мг в минуту вслучае натриевой соли 2-оксо-ме 45тилпентановой кислоты в качествесубстрата, 400 ммоль/л Формиата аммония, 25 С и рН 8) в форме водногораствора Фосфата калия (10 ммоль/л,рН 7), Затем следующие 5 ч дозируют раствор субстрата. После этогоустанавливают скорость подачи субстрата при значении 11,3 мл/ч и добавляют 2,88 мл раствора коферментак ферменту который содержит3,92 ммоль/л НАДН, связанного с полиэтиленгликолем со средней мол.массой 10 000 в форме водного раствора, в котором с помощью раствораедкого натра установлено рН 8. Приэтом соотношение активностей форми-,60атдегидрогеназы к лейциндегидрогенаэе составляет 1;2, Процесс контро"л 1 руют с помощью встроенной в поток. Фильтрата проточной кюветы поляриметра. Дифференциальное давление 65 над мембраной постепенно повышаетсядо 0,35 бар и затем остается постоянным, В течение 205 ч (8,5 дней) получают 202 ммоль Ь"лейцина . Максимальная скорость процесса составляет 1,12 ммоль Ь-лейцина в час. Выход целевого продукта 87,2, оптическая чистота 100.П р и м е р 5, Термостатируемый при 25 С реактор объемом 10 мл с плоской мембраной, который снабжен магнитной мешалкой и упьтрафильтрационной мембраной диаметром 62 мм с номинальной границей исключения 5000 (фирма-постановщик фАмиконф,Виттен, тип УИ 5), с помощью установ.ленного на скорость подачи 20 мл/ч дозирующего насоса примерно в течение 5 ч для стерилизации промывают 70-ным водным раствором этанола. Затем в течение следующих 5 ч раствор.этанола вытесняют дистиллированной водой, После этого со скоростьюподачи 20 мл/ч примерно в течение2,5 ч подают профильтрованный черезстерильный фильтр (0,2 мкм) растворсубстрата, который содержит100 ммоль/л натриевой соли 2-оксо 4-метилпентановой кислоты,400 ммоль/л Формиата аммония и50 ммоль/л однозамещенного фосфатанатрия, и с помощью раствора едкогонатра устанавливают рН 8. Затем вмес.то раствора субстрата дозируют 7, мл раствора кофермента, который содержит 3,80 ммоль/л НАДН, связанного с полиэтиленгликолем среднеймол. массы 10 000, и 50 ммоль/л фосфатного буфера с рН 8После этогодозируют 6).,5 формиатдегидрогеназы (активность 2,60 мкмоль/мг в минуту при формиате в качестве субстрата 25 С и рН 8) в форме водного раствора глицерина (50 вес; глицерина;10 мл Формиатдегидрогенаэы/мп)Вслед за этим далее дозируют описанным образОм раствор субстрата. Спустя примерно 5 ч поток субстрата уменьшают до 2 мл/ч,Затем в реакционный объем перед мембраной через боковое отверстие с помощью шприца добавляют 31,6 мг лейциндегидрогеназы (активность 11,48 мкмоль/мг в минуту в случае натриевой соли 2-оксо-метилпентановой кислоты в виде субстрата, при концентрации 4 ДО ммоль/л Формиата аммония, 25 С и рН 8) в форме водного раствора Фосфата калия(10.ммоль/л 4,2 мг лейциндегидрогеназы/мл) . Соот ношение активностей формиатдегидро" геназы и лейциндегидрогеназы составляет 1:2,3. Процесс контролируют с помощью встроенной в поток фильтрата проточной кюветы поляриметра.Дифференциальное давление над мембраной устанавливается при значенииЭакаэ 11508/59 Тираж 410. ПодписноеВНИИПИ государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, 3-35, Раущская наб., д. 4/5 филиал ППП фПатентф, г.уагород, ул,Проектная, 4 0,35 бар и затем остается постоянным. В течение 1152 ч 48 дней) получают150 ммоль Ь-лейцина.Максимальная ско 8рость процесса составляет 0,20 веюльЬ-лейцина/ч.Выход целевого продукта65,1; оптическая чистота 100.У