Способ получения нуклеазы

(72) Авторы кзобретеккя иериня А. Зейдака, Л. А А.(71) Заявите СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ 51 Изобретение относится к способам получения нуклеазы 511 ЕС 3. 1.4. 21 )- одноцепочной нуклеат-олигонуклео-, тид гидролазы, применяемой в молеку- лярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты и строения рибосомальной, транспортной и вирусной рибонуклеиновой кислоты, в генетической инженерии для получения рекомбинатных молекул и при получении 5-рибо- и 5-дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеиновой кислоты и денатурированной дезок.сирибонуклеиновой кислоты. 1Известен. способ получения нуклеазы Ь из вмилоризина путем термообработки при 70 вС, высаливания сульфатом аммония (70-100 степень насыщения), диализа и хроматографии на сульфосефадексе СПпри рН 3,8 и на сефадексе 6-75. Достигаемый вы; ход нуклеазы 5116 при удельной активности 150 ед/мг 11 1 Однако способ имеет недостаточную высокую активность фермента, необходимость двукратной хроматографии, осложняющей процесс.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения нуклеазы 5, включающий экстрагирование такадиастазы, осаждение сульфатом аммония до насыщения 60-90 диализ, хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0 ступенчатое элюирование, при этом используют 0,01 М калий Фосфорнокислый одно- замещенный и 0,05 М натрия хлористый в 0,01 М Фосфатном буфере, 0,02 М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,01 М натрий хлористый в 0,01 М Фосфатном буФере:,0,04 М калий Фосфорнокислый однозамещенный и 0,2 М натрий хлористый и 0,01 М Фосфатном буфере, 0,04 М калий фосфорнокислый однозамещенный и 0,5 М натрий хлооис2 45,7 и добавляют сульфат аммония до0,65-0,95 насыщения, осадок отделяютцентрифугированием и растцоряют врастворе ацетата аммония рН 5,05,5, содержащего ионы цинка, диализуют и. наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешеннуюраствором ацетата аммония рН 5,0-5,5,содержащим ионы цинка. Элюцию проводят линейным градиентом ацетата аммония от 0,02 до 0,5 М. Фракции,содержащие нуклеазу 5 объединяют, Полученная нуклеаза,5 является гомогенным белком при электрофорезе вполиакриламидном геле и не содержит примесей других ферментов, расщепляющих рибонуклеиновую кислоту инативную дезоксирибонуклеиновую кислоту.П р и м е р . Культуральную жидкость Азр. огугае 3-9-15 (500 мл), выраженную на питательной среде, содер. -жащей ионы цинка с нуклеазной активностью 220 ед/мл подкисляют дорН 5,7 и добавляют сульфат аммониядо насыщения 654, центрифугируют40 мин при 500 об/мин. К центрифугу добавляют сульфат аммония донасыщения 951 и оставляют на 1520 ч. Раствор центрифугируют 1 чпри 9000 об/мин и полученный осадокрастворяют в 0,02 М растворе ацетата. аммония, содержащего 0,1 М ионовцинка и диализируют против 0,02 Мраствора ацетата аммония, содержащего0,1 М ионов цинка, Наносят на колонку с диэтиламиноэтилцеллюлозной(2 х 30 см), уравновешенной 0,02 М раствором уксуснокислого аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка и элюируют градиентом от 0,02 И до 0,5 Мраствора аммония уксуснокислого, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Фракции, содержащие нуклеазу 51 объединяют,3 99850 тый в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0, Нуклеаза 5 элюируется О,ОЙ И калием фосфорнокйслым однозамещенным и 0,2 М.натрием хлористым в 0,01 И фосфатном буфере рН 7,0, после чео про-з водят гельхроматографию на сефадексе 6-75.Получают препарат нуклеазы 5: активность 18125 ед/мг белка, выход.30, степень очистки 10000 раз Г 2 . 10Однако известный способ имеет сравнительно низкое качество полученного препарата (имеются примеси рибонуклеаз Т и Т 2 , фосфодиэстераз, ферментов, расщепляющих нативную дезоксири бонуклеиновую,кислоту). Сложность процесса -.повторная очистка препарата .гельхроматографией на сефадексе 6-75.Целью изобретения является повышение активности и качества нуклеазы 20 5 (под повышением качества понимают отсутствие примесей сопутствующих Ферментов).Поставленная цель достигается способом получения нуклеазы 51 на осно ве продуцента Азрес 9111 цз огугае, включающим фракционированное осаждение белков сульфатом аммония и выделение нуклеазыхроматографией на диэтиламиноэтил-целлюлозе, причем З 0 в качестве источника нуклеазы 5. используют культуральную жидкость, Азрег 91110 з огухае 3-9-15, полученную при культивировании на питательной среде, обогащенной сульфатом цинка в количестве 0,05-0,07 вес.3, фракционированное осаждение осуществляют при степени насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония 0,65-0.,95, а. хроматографию проводят при рН 5,0-5,5 в среде ацетата аммония, содержащего 0,1-1 мИ ионов цинка , с элюцией линейным градиентом указанного .растВора ацетата аммония в пределах концентраций 0,020,5 И.Способ осуществляют следующим образом.Культуральную жидкостьАзр. огу-: аае, выращенную на известной питательной среде 3 1, обогащенной сернокислым цинком, и обладающую нуклеазной активностью, подкисляют до рН Результаты очистки приведены втабл.1.В результате получают 1 О мл фер ментного раствора, активность23,300 ед/мг белка, выход 23/ по активности, степень очистки 160 раз7 , 998502 8Определение активности нуклеазы 51 до 23.300 ед/мг белка и выхода по Активность нуклеазы 5 определяют по активности 2 Я . Упрощается процесс расщеплению ферментом денатурирован- выделения фермента, так как исклюной ДНК при рН 1,6.чается дополнительная очистка на сеЗа единицу активности принима фадексе Г. ется количество фермента, которое Для характеристики качества прегидролизует 1 мг денатурированной паратов нуклеазы 5 определялись акдезоксирибонуклвиновой кислоты заОтивность фермента активность на наФмин при 37 С и рН 1,6. тивную ДНК, кислая и щелочная Фос-Технико-экономический эффект предв фодиэстераза и кислая и щелочлагаемого изобретения заключается ная фосфомоноэкстераза в повышении активности нуклеазы 5 Результаты приведены в табл,2,Таблица 2 Фермент Показатели Величинаактивности Удельная активность,ед/мг белка Нуклеаэа 5,23 300 Удельная активностьпримесей расщепляющихнативную ДНК,4 0,21 Фосфомоноэстераза(щелочная 1 ед/мг белка 0,003 Фосфодиэстераза (кислая),ед/мг белка фосфодиэстераза (щелочная),ед/мг белка 0 ВНИИПИ Заказ 1071/М 5 Тираж 521 Подписное Филиал ППП "Патент", гУжгород, ул, Проектная,Результаты показали, что нуклеаза 5 1 содержит только 0,24 ДНК - азы и практически не содержит примесей.Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в превышении активности нуклеазы 5. и ее качества.Формула изобретенияСпособ получения нуклеазы 5 на основе продуцента Азрего 111 цэ огугае,включающий фракционированное осажде 45ние белков сульфатом аммония и выделение нуклеаэы 5 хроматографией на де.этиламиноэтил-целлюлозе, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения активности получаемого Фер"мента и улучшения его качества, в30качестве источника нуклеаэы 5 используют культуральную жидкость Азрег 9111 нэ огугае 3-9-15, полученную прикультивировании на питательной .среде, обогащенной сульфатом цинка в количестве 0,05-0,07 вес. Ж Фракционированное осаждение осуществляютпри степени насыщения культуральной жидкости сульфатом аммония 0,650,95, а хроматографию проводят прирН 5,0-5,5 в среде ацетата аммония,содержащего 0,1-1 мМ ионов цинка, сэлюцией линейным градиентом указанного раствора ацетата аммония в пределах концентраций 0,02-0,5 М.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Сенченко В. Н. и др. Получение и некоторые характеристики функционально-гомогенного препарата нуклеазы 5 иэ амилориэина. "Молекулярная бйология", 1979, т. 13, 6,с, 1377-1383.2. д. Апдо ВосЬв, В 1 орЬуэ, Асйа1966, 1 44, 158-168.3. Авторское свидетельство СССРУ 328716 у кл. С 12 М 9/28, 1970.