Способ количественного определения саркоплазматического ретикулума в мышечной ткани

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциалистическикреспублик и 934375(51)М. Кл. Гбвудэрсткинньй квннтвт СССР вв делан нзобретеннй и открытий(72) Авторы изобретения Д.О.Левицкий, Д.С.Беневоленский и Т,С.Левченко Всесоюзный кардиологический научный цейтр АМН-:ССОР:. .(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ1Изобретение относится к биохимии.Существующие электронно-микроскопические методы позволяют оценитьтолько объем, занимаемый саркоплазматический ретикулум (СР), но недают информации о количественномсодержании функционирующих мембранНаиболее близким к предлагаемомуявляется биохимический метод, примененный Яо 1 ого, Згцця. Ткань левого желудочка сердца собаки гомогенизировали в течение 40 с при скорости порядка 15000 об/мин в 4 объемах 0,3 М сахарозы и 1 О мМ имидазола (рН 7,0), Из части гомогената выделяли микросомы путем дифференциального центрифугирования с последующей отмывкой полученного препарата отактомиозина в 0,6 М КС 1 и определяли способность выделенных микросом и гомогената к АТФ зависимому поглощению кальция в присутствии оксалата 2 1,Согласно полученным результатамсердце собаки содержит в среднем6,8 х Р мг СР в 1 г ткани, где Рфактор очистки (меньше единицы),который остался неизвестным, так как 5исследователи не могли установитьстепень чистоты полученного ими препарата СР. Таким образом, в даннойработе не было определено действительное содержание СР.Цель изобретения - повышение точности определения.Указанная цель достигается тем,что получают суммарную фракцию дробным выделением, а изолированнуюфракцию очищают путем осаждения в градиенте плотности сахарозы, причемперед ее очисткой в последнюю добавляют оксалат кальция, а в качествеспецифического маркера используюфосфорилированный интермедиат Сазависимой аденозинтрифосфатазы .Суммарную фракцию получают путемпроведения 12- 15 циклов дробного вы5 934375 6 кулы СР были экстрагированы из мышцы, плотности сахарозы получен осадок очитак как выход СР в последних цик- щенных везикул СР (10 мг белка). Фрак" лах выделения незначителен. ,ция чистого СР способна включатьКоличество фосфорилированного бел,5 нмоль неорганического фосфата кового интермедиата в суммарной % на 1 мг белка. фракции микросом составляет 5,8 нмольР 1/г сырого веса ткани. Отношение суммарного количестваПри выделении изолированной фрак- фосфобелка, содержащегося в СР, лолции микросом максимальная кальций-ок- ностью извлеченном из 1 г сердечной салатная емкость составляет 10 мыщцы 5, 8) к количеству фосфата, 3, 6 мкмоль Са+мг белка. После насы- включенного в 1 мг ( по белку/ чистой щения везикул СР оксалатом каль" ,фракции СР ( 2,5) дает содержание СР ция до 154 от максимальной величи- в 1 г сырого;веса мышцы сердцаны и центрифугирования в градиенте2,3 мг/г. фракция СР Содержание АТФ-зависимое свябелка, мг/г зывание Са, нмоль ткани СА/г/с Количествофосфобелка,нмоль Р 1/г ткани 8,7 0,69 0,31 0,39 0,84 0,69 13, 1 0,6 8,4 0,69 9,7 0,57 0,75 0,6 6,3 0,5 0,46 0,78 1,06 0,66 6,4 0,28 0,79 0,39 0,81 3,7 10 0,76 0,21 2,3 0,19 0,69 0,6 Оу 13 0,510,6 О, 11 0,5 0 5 15 75,6 5,79 10, 12 Всего лума в мышечной ткани, включающийопределение соотношения количестваспецифического маркера в суммарнойфракции и изолированной фракции,Формула изобретения 1, Способ количественного определения саркоплазматического ретику1Составитель Т.Чечеватова Техред А. Ач Корректор О,Билак Редактор В, ПилипенкоЗаказ 3927/40 Тираж 887 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 7 934375 8выделенной путем гомогенизации и диф- получают путем проведения 12-15 цикференциального центрифугирования, о т лов дробного выделения, каждый из л и ч а ю щ и й с я тем, что, с це- которых включает гомогениэацию и лью повышения. точности определения, дифференциальное центрифугирование. получают суммарную фракцию дробным .3, Способ по п.1, о т л и ч а ювыделением, а изолированную фракцию щ и й с я тем, что хлористый кальочищают путем осаждения в градиенте ций в изолированную Фракцию добавляплотности сахарозы, причем перед ют в количестве 5-153 от количества, ее очисткой в последнюю добавляют необходимого до насыщения им везикул хлористый кальций в присутствии АТФ о саркоплазматического ретикулума.и оксалата, а в качестве специфи- Источники информации,ческого маркера используют фосфори- принятые во внимание при экспертизе лированный интермедиат Са - эави" 1. Ащегсап доигпа 1 Сагд 1 о 1 оду симой аденозинтрифосфатаэы. 1973, 31, р.172- 181.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю 2., С 1 гси 1 а 11 оп Йеэеагсп, 1974, щ и й с я тем, что суммарную Фракцию 34, р 531-550.