Способ определения активированных т-лимфоцитов в крови

.9180, А СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 6 01 М 33 48 Й ИОМИТЕТ СССРРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ БРЕТЕНИЯ ГОСУД АРСТВЕНН ПО ДЕЛАМ ИЗО АНИЕ К АВТОРСКОМУ. С(21) 2719980/28-13 , ч а.ю щ .и й с я тем, ч (22) 02,02,79 : :,повышения точности спос (46) 23,06,83. Бюл. Р 23 . .вирование проводят в те (72) Ь.К. Фролов и Б,К; Фролов 156. ч, а колхицин вводят (53)дб 12.07(088 8) ,:., ". Рации. 0,5 мкг/мл, после (56) 1. Колесникова АФ, Показатели жают кУльтивирование в клеточного иммунитета при острой1,5-2 ч, затем культуру дизентерии, 1976, Х 7 с, 8796. гируют, обрабатывают ги .(54)(57) СПОСОБ ОЦРЕДЕЛЕЙИЯ АКГЙВИ.- .ким раствором, затем по РОВАННЫХ т-ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ, . 1 рифугируют и при наличи . Включающий их культивирование в пи- ассоциирующих акроцентр тательной среде, введение колхицина. .мосом в лиммфоците опред и приготовление мазков, о т л и- ,вированныеТ-лимфоциты. о, с целью ба, культи- ение 52- и концентчего.продолечениецентрифуертоничесторно центдо двух ческих хро" ляют актиИзобретение относится к медицине, а именно к иммуннологическимспособам исследования и касаетсявыявления в организме активированных лимфоцитов,Известен способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови,включающий их культивирование впитательной среде и приготовлениемазков (.13.Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительностии точности.Целью изобретения является повышение точности способа,Цель достигается тем, что при,осуществлении способа активированных Т-лимфоцитов в крови, включающего их культивирование в питательной среде, введение колхицина иприготовление мазков, культивирование проводят в течение 52-56 ч,а колхицин вводят в концентрации0,5 мкг/мл, после чего продолжаюткультивирование в течение 1,5-2 ч,затем культуру центрифугируют, обрабатывают гипертоническим раствором, затем повторно. центрифугируюти при наличии до двух ассоциирующих акроцентрических хромосом влимфоците определяют активированные Т-лимфоциты.Способ осуществляют следующимобразом,Ставят культуру лимфоцитов с добавлением фитогемагглютинина (ФГА),Для постановки культуры у обсле-.дуеьых людей берут кровь из веныили из пальца в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепари. на 20 ед/мл). Кровь смешивают спитательной смесью 1:15. Питательная смесь состоит из среды 199, содержащей 10 человеческой резус-положительной сыворотки группы АВ(1 Ч),100-200 ед/мл антибиотиков и 20 мкг/млФГА, Всю работу по приготовлениюкультуры проводят стерильно, культуру инкубируют в термостате в течение 52-56 ч при 37 фС, затем в неедобавляют колхицин (конечная концентрация колхицина в среде0,5 мкг/мл). Инкубацию культуры сколхицином продолжают в течение1,5-2 ч при том же режиме. В присутствии колхицина в.культуре накапливаются клетки в стадии метафазы.Так как колхицин разрушает клеточное веретено, последующие стадии митоза не наступают, а в стадии метафаэы хромосомы наиболее доступныдля подробного морфологического изучения,Прекращают инкубацию культуры до 53-60 ч, когда лимфоциты делятся только первый раз, и частота ассоци,аций акроцентрических хромосом в нихсоответствует таковой до введенияих в культуру. После укаэанного срока часть лимфоцитов делится уже второй раэ, и частота ассоциаций акроцентрических хромосом в них будетменьше исходнойПосле инкубации культуры с кОлхйцином взвесь клеток культуры цент- .рифугируют в течение 5-10 мин при800-1000 об/мин, Надосадочную жид".кость удаляют, а клеточный осадокподвергают гипотонической обработке, для чего на него наслаивают .0,56%-ный раствор хлористого калия,осадок ресуспендируют в раствореи помещают в термостат при 37 С на 10 15 20 5-10 мин, Затем клетки снова центрифугируют при том же режиме, надосадочную жидкость удаляют, а клеткификсируют смесью метилового спиртаи ледяной уксусной кислоты (соотношение спирта и кислоты 3:1). Фиксацию проводят следующим образом:на клеточный осадок наслаивают охлажденную до 4-8 С фиксирующуюсмесь, клетки ресуспендируют в ней,и взвесь помещают на 15-20 мин вхолодильник (температура 4-8 С),После экспозиции в холодильникевзвесь центрифугируют при описанномвыше режиме, надосадочную жидкостьудаляют, а фиксацию клеток повторяют при том же режиме еще 2-3 раза.После последней фиксации осадокклеток ресуспендируют в небольшом З 5 количестве фиксирующей смеси (0,4"0,6 мл), и полученную взвесь наносят на обезжиренные и охлажденныепредметные стекла. Полученные препараты высушивают и окрашивают по 40 Романовскому-Гимэа или ацето-орсеином. Окрашенные препараты иссле,дуют под микроскопом с иммерсией(объектив х 90, окуляр х 10).Изу,чают лимфоциты, находящиеся в ста.45 дии метафазы, в которых подсчитывают количество ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ) ЗаААХ принимают такое расположениехромосом, когда они ориентированыдруг к другу своими короткими плечами, и расстояние между ними неболее половины длинного плеча "хро,мосомы 0 (большого акроцентрика)или не более всего длинного плечахромосомы Й (малого акроцентрика).У привитых вирусными вакцинами (оспенной, паротитиой) и у больных гриппом в изученной клеточнойпопуляции достоверно возрастало количество лимфоцитов с 0,2-мя акро" 60 центрическими хромосомами й ассьци-.ации"и соответственно уменьшалоськоличество лимфоцитов.с 4-мя и бо-.лее хромосомами в ассоциации. Клет. ки с 3-мя акроцентрическими хромо сомами в ассоциации существенных.Заказ 4386/41 Тираж 873 Подписное ВНИИПК Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патентф, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 личественных изменений не претерпевали. У привитых и у больных в Ответ на антигенный раздражитель увеличивалось количество активно пролиферирующих (размножающихая) Т-лимфоцитов с короткой интерфазой, т.е. количество активированных лимфоцитон. К последним можно отнести лимфоциты с 0-2-мя акроцентричее- . кими хромосомами в ассоциации.Группы обследованных привитых бы.ли представлены детьми 1-2, 5-6 и 8 лет и подростками 15 лет, больные гриппом представлены взрослыми от 22 до 46 лет.1. Увеличение количества активированных Т-лимфоцитов (содержат 02 акроцентрических хромосомы в ассоциации), выявляемых по предлагае.мому способу, имело положительную корреляцию с приростом специфичесих антител и количеством антигенчувствительных лимфоцитов у обСле/цованных, что подтверждает достоверность способа. Несмотря на то,1 то антитела вырабатываются не Т-,а В-лимфоцитами, между этими вида"ми клеток в процессе иммуногенезасуществует тесная коорерация. Следовательно, лимфоциты, которые проходят первый цикл деления в культуре, стимулированной фитогемагглютинином, и содержит 0-2 акроцентри ческие хромосомы в одной ассоциации, можно считать активированнымиТ-лимфоцитами, образовавшимися .ворганизме после серии митозов подвоздействием антигенов.15 Предлагаемый способ не требуетдля своей реализации дорогостоящейаппаратуры и дефицитных реактивов,позволяет среди активированных лимфоцитов выявлять только Т-клетки.20 Предлагаемый способ более чувствителен, так как позволяет болееточно выявлять в организме активированные лимфоциты.