Способ получения активированных носителей

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ТЕЛЬСТВУ Сеез Сееетских Социаэктическик Республик(61) Дополнительное к авт. свид-ву122) Заявлено 01,0677 (21) 2490496/23-04 рцм. к . с присоединением заявки йо С Оф 7 6 7/02 Государственный комитет СССР но аедаи изобретений н открмтий(23) Приоритет -Опубликовано 300881, бюллетень Й 9 32 Дата опубликования описания 30.0881,(53 УДК 577.15.07( 54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВ ИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕИ Изобретение относится к химическойи микробиологической промышленностии может быть использовано для получения активированных носителей для иммобилизации Ферментов. Получаемые5материалы могут быть применены какхимические реактивы и промышленныекатализаторы для проведения ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пищевых отраслях промышленности.Иммобилизация ферментов путем ихприсоединения к нерастворимым носителям является хорошо известным способом улучшения технологических показателей этих биокатализаторов.Из большого числа носителей заслуживают внимания органоминеральныематериалы, в частности покрытые полимерами пористые кремнеземные материалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточной ста"бильностью получаемых препаратов. Свойства получаемых препаратов во25 многом зависят от метода внесенияи активации полимерного слоя на носителе.Известны способы получения модифицированных твердых носителей путем 30 покрытия поверхности носителя полимером. Например, в качестве полимера используют полиакролеин. Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывання носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировкиПолимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реакции междуальдегидными группами носителя и аминогруппами фермента 1) Этот способ позволяет получать иммобилизованные на органоминеральных носителях ферменты. Однако он ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами, Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить активные препараты. Кроме того, получаемые линейные полимеры обладают значительной растворимостью и не скрепляют неорганическую структуру носителя.Известен также способ получения водонерастворимого гидрофильного носителя со свободными карбонильными (преимущественно альдегидными) группировками в результате полимериэацииакролеина или сополимеризации акролеи- на й стирола в присутствии 1,6-гексаметилендиамина. Иммобилизацию фермента производят также с помощью реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента (2.Данный способ ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить препараты с удовлетворительной стабильностью. Иммобилизованные ферментные препараты, полученные данным способом, обладают очень низкой стабильностью при хранении и только использование дополнительных приемов способствует некоторому повышению стабильности препаратов.Известен также способ получения воднонерастворимого ферментного препарата путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, причем фермент предварительно адсорбируют или ковалентно связывают на поверхности неорганического носителя. Полимер образуется из полиамина (например, гексаметилендиамина или этилендиао мина) и полиизоцианата при 0-4 С 3.Способ иммобилизации ферментов покрытием уже связанного фермента полимерной микрокапсулой создает дополнительное диффузионное сопротивление для субстрата. Катализаторы, полученные путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, могут оказаться трудно применимыми при проведении гидролиза макромолекулярных субстратов, в частности, таких, размер молекул которых превышает или равен размерам молекул иммобилизованного фермента.Предложены для иммобилизации ферментов стеклянные шарики, покрытые полимерным слоем, В качестве полимера используют гидролиэованный найлон или сополимер этилена и ангидрида малеиновой кислоты. Полимерный слой пропитывают раствором фермента и по- перечно сшивают глутаровым альдегидом 4)Описанный способ дает материалы с хорошими гидродинамическими показа" телями, но сравнительно небольшой удельной поверхностью. Кроме того, этот сйособ, по которому сшивание полимерного слоя сочетается с иммобилиэацией фермента, не позволяет провести реакцию в условиях (напри" мер, при повышенных температурах), необходимых для получения стойких полимерных носителей,так как при этих температурах часто протекает инактивация фермента.Известен также способ получения активированного носителя путем пропит ки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом. В качестве полимсра исполь зуют полиакролеин, Носитель (фарфор,измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимериэацияпроисходит на поверхности носителя,В результате модификации таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами, Иммобилизация фермента (трипсина, папаина)производится путем, взаимодействияальдегидных групп носителя с аминог 10 руппами фермента (5).Недостатком данного способа является малая операционная стабильностьполучаемых активированных носителей.Покрытие неорганического материала15 линейными полимерами, образующимисяпри полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточнуюнерастворимость, а следовательно,стабильность получаемых ферментныхщ препаратов. Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегидсодержащими полимерами, а связывание ферментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность получать препараты с высокой активностью и хорошей стабильностью. Известный способ не обеспечивает также высокого содержаниябелка на единицу носителя. При иммобилизации трипсина достигается связывание 0,2 мг белка на 1 мл носителя.Цель изобретения - повышение операционной стабильности носителей дляиммобилизации биоактивных веществ.Укаэанная цель достигается тем,З 5 что в способе получения активированных носителей с повышенной операционной стабильностью путем покрытияпористого неорганического носителя сдиаметром пор 200-2000 Й органичесд) ким пленкообразующим веществом, содержащим реакцнонноспособные группы,в качестве пленкообраэующего вещества используют эпоксидную смолу и проводят ее отверждение на носителеполиэтиленполиамином в соотношенииэквивалентов эпоксидной смолы иамина 1:2 при 100-120 С в течениене менее 1 ч, после чего материалобрабатывают реагентсбй, выбраннымиэ группы, включающей глутаровый альф дегид, динэоцианат адипиновой кислоты,-бензохинон и бромциан,Способ осуществляется следующимобразом.Пористые неорганические носителиИ с диаметром пор 200-2000 А (силохром или силикагель) смачивают 1,7 ным раствором эпоксидной смолы в ацетоне (9 объемов раствора на 5 вес.ч.неорганического носителя). Ацетонщ выпаривают и проводят затвердениепосредством кипячения носителя в 2 ном водном растворе полиэтиленполиамина (соотношение эквивалентовэпоксидной смолы и амина 1:2) в течение 1 ч. Носитель отфильтровыва"30 ют, промывают водой, ацетоном и сушат в термостате при 100 фС. В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150-200 мкэкв на 1 гносителя. Носитель можно использовать непосредственно для иммобилизации белков за счет взаимодействия, с аминогруппами, а также можно дополнительно активировать, создавая ,на полимерной пленке реакционноспособные группы различной прирбды. О Подходящими активаторами в данном случае являются глутаровый альдегид, дииэоцианат адипиновой кислоты и - бенэохинон и бромистый циан. Активацию укаэанными реагентами проводят 15 описанными в литературе методами.П р и м е р 1. Получение носителя, модифицированного эпоксидной смолой.Для получения носителя проводят пропитывание кремнеэемного материала 20 раствором эпоксидной смолы и затем затвердение водным раствором полиэтиленполиамина в количестве свыше эквимолярного (соотнсшение эквивалентов 1:2) . 255 г силохрома или силикагеля смачивают 9,0 мл раствора 1,7 эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя проводят затвердение15 мл 2-ного водного раствора полиэтиленамина кипячением при 100 С втечение 1 ч. Затем носитель Фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают в термостате при 100 С.В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150 мкэкв на 1 г носителя. Полученный носитель используют для иммобилизации протеолитических Ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью 40 бифункциональных реагентов глутарового альдегида и диизоцианата адипиновой кислоты, п -бензохинона и бромциана.П р и м е р 2. Получение нераст воримого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием глутаровым альдегидом.К 5 г модифицированного эпоксид ной смолой носителя (пример 1) добавляют 15 мл 2-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого материал омывается дистиллированной водой от непрореагировавшего. 1. глутарового альдегида на воронке Бюхнера до исчезновения глутарового альдегида в промывной воде, и к влажному активированному носителю добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 50 мг/мл в боратном буфере рН 8,0. Смесь перемешивают, вакуумируют для удаления воздуха из пор и выдерживают при 20 С в 5 течен(е 1 ч. После инкубации препарат промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1 М раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод составляет 100 млПолученный иммобилизованный препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике.Ферментативную активность препарата определяют на синтетическомсубстрате - этиловом эфире ацетилтироэина (АТЭЭ). Активность равна550 Е/г. Стабильность препарата оценивают по остаточной активностипосле проведения промывки препарата100 мл 2-ного раствора казеина рН8,0 в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой помывки сохраняется 70 от исходной активности.П р и м е р 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, актнвированием диизоцианатом адипиновой кислоты.К 5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуолеи смесь кипятят при 110 С в течение1 ч. После этого носитель фильтруют,промывают ацетоном и высушиваю-. при110 С. Вследствие такой обработкиполучают носитель с активными изоцианатными группами. Такой носительсмачивает 8 мл боратного буФера,Иммобнлизацию проводят как описанов примере 2. Получают препарат химотрипсина с активностью на АТЭ 91900 Е/г. После промывки препарата2-ным раствором казеина сохраняется 41 исходной активности. При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 Е/г(на АТЭЭ),после промывки казенном сохраняется32 от исходной активностиП р и м е р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием р -бензохиноном.5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 0,5-ного водного раствора и -бензохинона на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель промывают водой и ацетоном и высушивают при комнатной температуре. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера, Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере 2. Получают препарат с активностью на АТЭЭ 6800 Е/г. После промывки препарата 2-ным раствором казеина остаточная активность составляет 57 от исходной.7 859372 Формула изобретения Составитель А. БочаровТехред Л. Пекарь Корректор Г. Назарова Редактор В. Петраш Тираж 397 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 7466/39 Филиал ППП фПатент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р 5. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием бромцианом.5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 1,1-ного водного раствора бромциана на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель промывают водой и высушивают при комнатной температуре. Получают носитель с активными (О циан-группами. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере 2 Получают препарат с активностью 15 33,6 Е/г (активность определяют на 2-ном казеине) . После промывки препарата 2-ным раствором казеина остаточная активность составляет 16 от исходной. 20Предлагаемый способ позволяет пофлучать носители, в которых внутренняя поверхность пор покрыта слоем действительно нерастворимого полимера, содержащего любые реакционноспособ ные группы, необходимые для иммобилизации ферментов. Образование в порах носителя полимерной пленки закрепляет структуру носителя, уменьшает нежелательное ацсорбционное 30 взаимодействие фермента с носителем и предотвращает вымывание фермента с носителя из-за растворимости кремнезема при рН 7 и выше. Способ позволяет получать препараты иммобилизо ванных ферментов с повышенной стабильностью и повышенной удельной активностью на грамм носителя. Способ получения активированныхносителей путем пропитки пористогонеорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения операционной стабильности получаемых материалов, вкачестве пленкообразующего веществаиспользуют эпоксидную смолу, проводят ее отверждение на носителе полиэтиленполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина1:2 при 100-120 С в течение не менее11 ч, после чего материал обрабатывают реагентом, выбранным из группы,включающей глутаровый альдегид, дииэоцианат адипиновой кислоты, -бенэохинон и бромциан.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Патент ФРГ М 2229298,кл. С 07 С 7/02, опублик. 1972.2. Патент ФРГ Р 2104810,кл. С 07 6 7/02, опублик. 1971.3. Патент Великобритании У 1396714,кл. С 07 6 7/02, опублик, 1975,4. С. Ногча 1 Ь. Ре 111 сц 1 аг 1 пвоЬ 111 зей епзукез В 1 осЬ. В 1 о):и. АсСа.1974 ю 358, 164-177.5. Патент Великобритании М 1342186,кл. С 07 Н 1/02, опублик. 1973 (прототип),