Способ количественного определения зеараленона в тканях животных

1Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)м. Кл. 6 01 Н 31/08 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 07,0480(54 ) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХИзобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения микотоксина ф-зеараленоналактона б-(10-окси-б-оксо-транс-ундеценил) к -резорциновой кислоты) в тканях животных,Известен способ определения микотоксинов в кормах, заключакщийся в обработке анализируемой пробы хлоро формом с последующей обработкойхлороформного слоя гексаном и бензолом, дальнейшей очисткой на колонке, заполненной силикагелем, и хромато- . графированием остатка в тонком слое 15 силикагеля 1). Таким способом невозможно опреде" лить зеараленон.К предлагаемому способу наиболее 2 близок способ количественного определения зеараленона в тканях животных, заключающийся в обработке анализируемой пробы хлороформом, очистке полученного раствора на колонке, запол ненной силикагелем, с последующим элюированием зеараленона смесью бензола и ацетона, концентрировании элюата с хроматографированием концент рата в тонком слое силикагеля 2. З 0 Недостатками такого способа являются низкие чувствительность(0,5 мг/кг)и избирательность определения.Целью изобретения является повышение избирательности и чувствительности определения. Цель достигается способом количественного определения зеараленона в тканях животных, заключающимся в обработке анализируемой пробы ацетоном, очисткеполученноГо раствора на колонке, заполненной окисью алюминия, с элюированием зеараленона смесью ацетона и воды, взятых в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, концентрировании элюата и хроматографировании концентрата в тонком слое силикагеля с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофенилдиазоний тетрафторборатом.Отличием предлагаемого способа является использование в качестве органического растворителя ацетона,качестве адсорбента окиси алюминия, троведение элюирования смесью ацетона и воды, взятых в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1 и,последующая обработка тонкослойной хроматогграммы и-нитрофенилдиазоний тетраФторборатом.П р и и е р . Для определениязеараленона 10 г гомогенизированногообразца (мышечная ткань, печень,почки, кровь, патологический материал)вносят в колбу емкостью 250 мл. Затемв нее вливают 60 мл ацетона и встряхивают на шуттель-аппарате в течение2 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу с притертой пробкой. Извлечение токсина повторяют,используя еще 60 мл ацетона. Объединенный экстракт переносят в фарфоровую чашку Р 13 и выпаривают накипящей водяной бане досуха. Полученный остаток очищают от коэкстрактив ных веществ на колонке окиси алюминияП степени активности для хроматографирования.Колонку для хроматографированияготовят следующим образом. 20В нижнюю часть колонки помещаюттампон ваты высотой -1 см, затем вносят 5 г окиси алюминия и промываютколонку 20 мл ацетона квалификациио.с.чх.ч. или после дистилляции, рОстаток в чашке после выпариванияэлюата,растворяют в 20 мл ацетонаи вносят в колонку. После того, какэкстракт опустится до верхнего краястолбика адсорбента, через колонку ЗОпропускают 150 мл чистого ацетона изатем 50 мл ацетона, содержащего 1воды. Токсин элюируют 50 мл смесиацетон-дистиллированная вода (9:1по объему). Элюат собирают в чашкуР 10 ивыпаривают на водяной банедосуха. Остаток в чашке растворяютв 30 мл ацетона и фильтруют черезбумажный фильтр в чистую фарфоровуючашку Р 10. Фильтрат выпаривают наводяной бане досуха.Полученный после выпаривания растворителя остаток в чашке растворяютв 1 мл бензола и полностью в 2-3 приема наносят на пластинкусилуфоламикропипеткой, используя струю горячего воздуха. Одновременно готовятсвидетели т.е. наносят на пластинку10 р 20 у 30 р 50 и 100 мкл растворазеараленона в бензоле, что соответс вует 1;2;3;5 и 10 мкг зеараленона,и выпаривают растворительОбразцынаносят на пластинку в следующейпоследовательности: 1 повторность,свидетели, 2 повторность. Размерпятен не должен превышать 0,5 см.Места нанесения проб располагают нарасстоянии 1,5-2 см от нижнего ибоковых краев пластинки и друг от друга. В камеру для хроматографирования вносят 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (в соотношении 601:3 по объему) и через 20 мин помещают пластинку в вертикальном положении.ПосЛе того как растворитель поднимется на высоту 10-12 см, пластинкувынимают, отмечают фронт растворите ля и помещают в сушильный шкаФ нао3 мин при 105 С. Затем пластинку опрыскивают. свежеприготовленным0,05-ным раствором прочного красного Ж в 50-ном этаноле и снова помещают в сушильный шкаф при этой же температу"на 5-7 мин,Зеараленон проявляется в виде ярко желтого пятна на белом Фоне с й 0,47 + 0,01. Количество токсина в пробе определяют, сравнивая интенсивность окраски иплощадь пятен свидетеля и образца. В случае, если содержание микотоксина в пробе превышает 10 мкг, то получают хроматограмму стандартов большей концентрации (10-20 мкг). Концентрацию Фв образце рассчитывают по формуле:АХРгде Х - содер;ание зеараленона в исследуемой пробе, мг/кг;А - количество токсина в навеске,мкг;Р в . вес пробы, гЧувствительность определения зеараленона в органах и тканях животных при навеске 10 г составляет 100 мкг/кг (0,1 мг/кг). Абсолютная чувствительность обнаружения стандартного вещества в тонком слое силикагеля (силуфола) составляет 0,25 мкг.Степень извлечения зеараленбна зависит от.соотношения между массой образца и объемом органического растворителя, а также от времени экст ракции. Если 10 г пробы встряхивать в течение 2 ч с 60 мл ацетона, то извлечение Фсоставляет 45 Ф 3. Увеличение времени экстракций повышает выход токсина только на 5-7. Двукратная обработка проб ацетоном порциями по 60 мл повышает извлечение зеараленона до 75-80, а при дальнейшей экстракции выход токсина возрастает незначительно (до 82-85). Причем аналогичная обработка проб хлороформом приводит к извлечению не более 60 токсина.Установлено, "что зеараленон прочно удерживается на колонке окиси алюминия. Применение силикагеля было малоэффективным из-за мешающего влияния коэкстрактивных веществ и слабой адсорбции зеараленона. При этом значительную роль играет элюент. Так, при десорбции зеараленона смесью ацетона и уксусной кислоты происходит разложение токсина и вьвь:вание большого количества мешающих анализу веществ. Элюирование ацетоном с добавкой гидроксида натрия также приводит к одновременной десорбции коэкстрактивных веществ. Наиболее приемлемым элюентом является смесь ацетона и дистиллированной воды в со726479 фоне пластинки наблюдают ярко желтыекомпактные, не обесцвечивающиеся прихранении хроматограммы пятна вещества без мешакщего влияния коэкстрактивных веществ. Интенсивность окраски пятен возрастает в интервале0,25-20 мкг, а минимально определяемое количество микотоксина в тонкомслое силикагеля оказывается равным0,25 мкг. Чувствительность обнаружения зеараленона в тканях животныхдостигает 100 мкг/кг, что в 5 раз выше по сравнению с известным способом.При облучении хроматограмм, полученных по предлагаемому способу,УФ-светом (256 нм) не наблюдаютфлуоресцирующих пятен, за исключением зон, соответствующих Ф, в товремя как при. экспозиции к УФ-свету(256 нм) хроматограмм, полученных поизвестному способу, проявляется множество пятен, флуоресцирующих голубым, синим и зеленым цветом, а идентификация зеараленона становится невозможной. При этом свидетель-зеараленон после вторичного облучения нефлуоресцирует,Преимущества способа согласноизобретению по сравнению с известнымприведены в таблице. Обнаружено зеараленона, мг/кг известнымВ - способом Исследуемый объекти его масса несено зеараленона,мг/кг по собственной люминесценции Мышечная тканькролика, 10 г 0,05 Не обнаруженТо .жеСледы 0,07 0,35 0,80 0,10 0,501,00 То же0,040,80 То жеНе обнаружен Не обнаружен Не обнаружен Печень кролика,10 г 0,05 0,07. 0,35 0,80 То же То же 0,10 0,5000 То же 0,40 0,80 Следыф Почки кролика, 10 г То же Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен 0,05 То жеСледы ф0,07 0,40 0,80 0,10 0,50 1,00 То же 0,50 1,00 полученного раствора на,колонке, заполненной адсорбентом, с последующим элюированием зеараленона, концентрированием элюата и хроматографированием концентрата в тонком слое, о т отношении 8,9-9,05:0,95-1,1. При меньшем содержании воды в ацетоне десорбции Фпрактически не происходит, или она очень слабая, а при высоком соотношении между ацетоном и водой на результаты анализа влияют коэкстрактивные вещества.Масса адсорбента в колонке оказывает действие на адсорбцию токсина и других соединений, Испытаны колонки с 2, 3, 5, 7 и 10 г окиси алюминия. Наилучшие результаты по степени десорбции Фи удерживания примесей получены с массой адсорбента, равной 5 г,С целью избирательного определения 15 зеараленона испытаны различные реакции с образованием окрашенных комплексов, Установлено, что Фпроявляет свойства фенола, вступая в реакции сочетания с 4-аминоантипирином, 20 диазореактивами, реагирует с реактивом Фолина-Чокальтеу. Однако чувствительность обнаружения Фпосредством 4-аминоантипирина и реактива Фолина-Чокальтеу не превышает 3-5 мкг.5 Фнаиболее четко проявляется диазореактивом -п-нитрофенилдиазоний. тетрафторборатом, При этом на белом Формула изобретения Способ количественного определения зеараленона в тканях животных пу- . тем обработки анализируемой пробы органическим растворителем, очистки 65предлагаемым способом по собствен- по реакции ной люминес- диазосочетаценции ния Не обнаружен Не обнаруженЗЙЩЯФфЯСбйсЫ" к .. , .-; -."ФР. ., туг: 726479 Составитель Л.Соломенцева,Редактор 3. Бородкина Техред О,Легеэа . КорректоР Г. НазаровайтаюВююЗаказ 648/35Тираж 1019 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Разыская наб., д. 4/5ММВБ МФЙяФ;Ьзжм-; -;:,.Ф - ., , , .гФилиал ППП Патент, г, УжгороД, ул. Проектная, 4"л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения избирательности и чувстви тельиости определения,.в качествеорганического растворителя используют ацетон, в качестве адсорбентаокись алюминия и элюирование прово" дят смесью ацетона и воды, взятых в5объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1,с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофенилдиаэоний тетрафторборатом.0 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Авторское свидетельство СССР9 389446, кл. С 01 Н 31/08, 1973,опублик.2, В. Ю. Ерр 1 еу, Ясгеев 1 пд ве 1 ЬойЕог Р, ай 1 а 1 ох 1 пв апй осЬ 1 аох 1 п,Аввос 1 а 11 оп ОН 1 се Апа 1 у 11 са 1СЫеа 3.ваяв, чо 1 51, 9 1, р. 74, 1968