Штамм.

(4(71) вател обильный. Ко Беннета. Росоричневого доимый пигментной агар. Рос Агании ски (72 ова,Востова,черного цвета.тсутствует.обильный. Колонии А.Д.И,П,димир Вла Лаз цвет тКоло метал ова,нико С.М, (53) (56) кл, 1 я. Рост хо творимый и ае ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ Всесоюзныи научно-исследо институт антибиотиков Л.П. Иваницкая, М.В. Биби Фадеева, Э.М. Сингал, С,Н Ю.В. Жданович, Р.Н, Елиза Кузовков, А,Н, Лобусева, Фомина, С.М. Навашин, А,В ов, Ю,Э. Бартошевич, Т,Н. а, Н.В. Орлова, А.С. Тихо Чайковская и Б.В. Розынов 615,45:615,779.931(088.8) Патент США Р 3907771, 95-80, опублик. 1968,(54)(57) ШТАММ МТСРОМОИОЯРОВА ГПЯЧАВ, Я 1 ЯОИУС 1 И 1 ЧАВ. БОЧ. 15-72-ПДУЦЕНТ СИЗОМИЦИНА, хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиковпод номером 15-72 и характеризуетсяследующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими иантибиотическими свойствами,Культурально-морфологические признаки. Спороносцы отходят от ветоксубстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглыес бугристой поверхностью, размером0,8-1,0 ц, располагаются на концекоротких спороносцев, часто образуягрозди,Среда Чапека. Рост удовлетворительный. Колонии оранжево-ржавые дотемно-коричневого, Растворимый пигмент отсутствует,12 Р 1/02, С 12 В. 1/29 Минеральная среда Р 1 Гаузе. Ростильный. Колонии гнедые до черногоета, Растворимый пигмент отсутству мно-каштанового до ржавого астворимый пигмент отсутств Соевый агар. Рост обильный.нии темно-каштанового цвета слическим блеском. Растворимый пигмеумбрового цвета,Ломтики картофел рошийКолонии черные. Рас игменотсутствует.физиолого-биохимические признакОптимальная температура роста 26-3При 50 С не растет, Желатину раэжижает умеренно.Молоко коагулирует быстро.Крахмал гидролизует умеренно.Меланиды не образует,Отношение к углеводам.оусваивхорошо сахарозу, маннит, крахмал,слабо галактозу. Не усваивает арабнозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рфинозу, инозит, сорбит.Антибиотические свойства.Подавляет рост грамположительныхи грамотрицательных бактерий ЯйарЬаигепз, Вас. зцЬгх 11 з, Вас. шусо 1 йез, МусоЬасгегшп риП, Яагсхпа.1 цг 1 а, Е, со 11, Рзеийошопа аегпддпоза, Ргогеиз чц 18 аг 1 з, Сошашопаз геггЦепа, РгочЫепса 1 згцагСН.Изобретение относится к медицине и касается получения антибиотиков.Известен штамм Мгсгошопозрога хпуоепзхз ИНКЕ 3292 - продуцент сизомицина.Недостатком данного штамма является низкий уровень активности культуральной жидкости.Цель изобретения - повьппение активности культуральной жидкости.Поставленная цель достигается путем использования штамма М.сгошопозрога Гцзса чаг. зхзошус 3.п 3. чаг. поч.15-72.Штамм Мгсгошопозрога Уцзса чаг. ззошус.пг чаг. поч. 15-72,выделен из лугово-каштановой оглееной почвы Крыма в районе Саки, депонирован и хранится в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института под номером 15-72 и характеризуется следующими культурально- морфологическими, физиолого-биохимическими и антибиотическими свойствами.Культурально-морфологические признаки. Спороносцы отходят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется, Споры круглые с бугристой поверхностью, размером 0,8-1,0 , располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя грозди.Штамм хорошо развивается на большинстве агаризованных сред. Субстратный мицелий оранжево-ржавый до коричнево-черного цвета. Растворимый пигмент на большинстве сред отсутствует, На соевой агаризованной среде образуется умбровый пигмент,Среда Чапека. 20 дней выращивания при 28 С, Рост удовлетворитель" ный. Колонии оранжево-ржавые (М) до темно-коричневых (Л). Здесь и далее окраска определена по таблице цветов Бондарцева. 1951 г. Растворимый пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарагиновый агар. 20 дней выращивания при 28 С, Рост хороший. Колонии темно-каштановые (О"7). Растворимый пигмент отсутствует.Крахмальный агар с растворимым крахмалом. 20 дней выращивания при 20 С. Рост обильный. Колонии темно- каштанового до буро-красного цвета (0-7 - В), Растворимый пигмент отсутствует. Минеральная среда 9 1 Гаузе, 20дней выращивания при 28 С. Рост обиль:ный. Колонии гнедые до черного цвета, (В- А). Растворимый пигмент5 отсутствует.Агар Беннета. 20 дней выращиванияпри 28 С. Рост обильный. Колонии коричневого до черного цвета(Л- А), Растворимый пигмент10 отсутствует.Овсяной агар. 20 дней выращиванияпри 28 С. Рост обильный. Колониитемно-каштанового до ржавого цвета(0-7 - Ж). Растворимый пигмент15 отсутствует,Мясо-пептонный агар, 20 дней выращивания при 28 С. Рост отсутствует.Агар с тирозином. 20 дней выращивания при 28 С. Рост слабый. Пигмент20 отсутствует.Соевык агар. 20 дней выращиванияпри 28 С. Рост обильный. Колониитемно-каштанового цвета с металлическим блеском (0-7). Растворимыйпигмент умбрового цвета (П),Ломтики картофельные. 20 днейвыращивания при 28 С. Рост хороший.Колонии черные. Растворимый пигментотсутствует.30Культура сохраняется на агаризованных средах под слоем вазелиновогомасла, на скошенном агаре при 5 С вотечение 6 мес,Физиолого-биохимические признаки,Оптимальная температура роста26-34 С.При 50 С не растет.Желатину разжижает умеренно (1421 день).Молоко коагулирует быстро (5-7день),Крахмал гидролизует умеренно(14 дней)Меланиды не образует (агар Треенера с лимоннокислым железом).Использование различных источниковуглерода (среда Придхе ма-Готтлиба).Хорошо растет в присутствии сахарозы,маннита и крахмала, Очень слабо - вприсутствии галактозы. Не растет вприсутствии арабинозы, лактозы, рамнозы, ксилозы, раффинозы, инозита исорбита.Антибиотические свойства.Культура 15-72 при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках (в ферментерах) на4-5 сутки образует антибиотик, подав з 7131 ляющий рост различных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий (Бгарй ацгеця,Вас. яцЪг 111 я, Вас. шусоЫея,МусоЪас геггцш рц 11 т, Багспа 1 цгеа, Е. со 1 т., Ряецт 1 ошопая аегцд 1 пояа, Ргогецв Чц 1 каг 1 в, Сошашопая гегггдепа; РготтЫепст.а ягцаггт.ъ) и не задерживает рост дрожжей и мицелиальных грибов СапдЫа а 11 сапв, Бассттагошусея сегечя 1 ае, Тогц 1 а 10 цайт.1 т.я, Аярег 8111 цв пднег, Регйст.1- 1 т.цш погагцш.На 10-12 сутки роста культура образует противоопухолевой антибиотик, который обладает действием т.п чегго только в отношении грамположительных бактерий, а 1 п тчо подавляет рост ряда экспериментальных опухолей,П р и м е р 1. Агаровым блоком из 10-14 суточной культуры Мсгошоповрога час, ядяошустп таг. поч.15-72, выращенных на минеральной среде Гаузе Р 1, засевают маточную колбу с посевной средой следующего состава, 7: 25Кукурузный экстракт 1 (технич.вес)Сернокислый аммоний 0,35Крахмал 1,5Глюкоза ф 130Хлористый натрий 0,5Углекислый кальций 0,5Значение рН среды 7,0, объем среды в колбах 100 мл; выращивание на качалках при 280 об/мин при 34 С в35 течение 72 ч. Мицелий из маточной колбы переносят в посевные колбы со 100 мл среды указанного состава. Культивирование посевных колб ведут так же, как и маточных, Мицелий из посевных колб используют в качестве инокулята при биосинтезе сизомицина в ферментерах или в колбах. Инокулят может быть получен также в ферментерах-инокуляторах. Для ферментации используют средуследующего состава, Е:Соевая мука 3Крахмал 4,5Сахароза 2 50Натрий азотнокислый 1Кальций углекислый 0,5Кобальт хлористый 0,8 мг/лЗначение рН среды 7,0.А). Ферментация на качалках: 96 - 55120 ч, 280 об/мин, 34 С, получаюткультуральную жидкость с содержанием270 мкг/мл сизомицина. 70 4Б). Биосинтез в ферментерах: засев в ферментерах производят инокулятом, взятым в количестве 10 Е отобъема ферментационной среды, ферментацию ведут при 34 С в течение96-120 ч, получают культуральную жидкость с содержанием 270-300 мкг/млсизомицина,По окончании ферментации 50 млкультуральной жидкости подкисляютщавелевой кислотой до рН 1,5-2,0,перемешивают 30 мин и фильтруют.Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиака дорН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованногофильтрата культуральной жидкости пропускают через колонку с 250 мл катионита КБв аммонийной форме. Поокончании сорбции колонку промываютводой и десорбируют сизомицин 2 н.водным раствором аммиака. Получают600 мл элюата, который упаривают ввакууме досуха. Остаток растворяют вминимальном количестве воды, подкисляют разбавленной серной кислотой дорН 4,0-4,5, осветляют раствор активи-,рованным углем и осаждают из растворасульфат добавлением 10-кратногоколичества метанола. Получают 24 гпрепарата с содержанием около360 мкг/мг сизомицина основания(8,6 г в пересчете на основание сизомицина). Неочищенный сульфат растворяют в минимальном количестве водыи вносят в колонку с 800 мл анионитаЗВА=401 Б. Антибиотик вымывают дистиллированной водой. Элюат упариваютдосуха. Остаток растворяют в смесиизопропанол-хлорофортт-,253-ныйаммиак(1:1:1 нижняя фаза), вносят в колонку с 500 г силикагеля марки КСК (иливодной кремневой кислоты) и хроматографируют в той же системе. Фракции,содержащие сизомицин, объединяют,упаривают досуха. Остаток растворяютв минимальном количестве воды, раствор подкисляют разбавленной сернойкислотой до рН 4,5, осветляют активированным углем. Сульфат сизомицина осажФдают добавлением к раствору 10-кратногоколичества метанола. Получают 7,8 гсульфата сизомицина с содержанием 600 мсг/млоснования сизомицина (в пересчете наоснование 4,8 г). П р и м е р 2. Агаровым блоком из10-14 суточной культуры Мхсгошопо -врога гцяса айаг. вяошуспг т 7 аг. поч.15-72 засевают маточную колбу с%,Кукурузный экстракт 0,7 (технич. 5 4 2,5%1 . (технич,вес)0,2 1,2 1,5 мг/л Натрий хлористыйКальций углекислыйКобальт хлористыйЗначение рН среды 7,0.А). Ферментация на качалках: в колбы на 750 мл наливают по 50,мл среды засевают по 5 мл инокулята,обиосинтез ведут при 34 С в течение 72-96 ч, получают культуральную жидкость с содержанием 320 мкг/мл сизомицина.Б). Биосинтез в ферментерах: засев производят инокулятом, взятым в количестве 10 от объема Ферментационной среды, Ферментацию ведут при 34 С 72-96 ч. Получают культуральную Корректор Е. Рошко Редактор П. Горькова Техред И,Попович Заказ 6499/3 Тираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 вес)Крахмал 2,5Углекислый кальций 0,8Сернокислый аммоний о 0,35Хлористый натрий 0,5Значение рН среды 7,0, объем средыв колбах 100 мл выращивание на ка 5очалках при 280 об/мин при 34 С в течение 72 ч, Мицелий из маточных колбпереносят в посевные колбы с 100 млсреды, указанного состава. Культивирование посевных колб ведут так же,как и маточных. Мицелий из посевныхколб используют в качестве инокулятапри биосинтезе сизомицина в Ферментерах или в колбах, Инокулят можетбыть получен в Ферментерах-инокуляторах,Для Ферментации используют срецуследующего состава:Соевая мукаКрахмалСахарозаКукурузный экстракт жидкость с содержанием 320 мкг/млсизомицина.По окончании ферментации 50 лкультуральной жидкости подкисляютщавелевой кислотой до рН 1,5-2,0,перемешивают 30 мин и фильтруют,Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиакадо рН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованно О го Фильтрата культуральной жидкостипропускают через колонку с 250 млкатионита КБв натриевой форме. По.окончании сорбции колонку промываютводой и десорбируют сизомицин 1 .н.15 водным раствором серной кислоты.Элюат нейтрализуют анионитом ЭДЭ в ОН Форме до рН 6,5-7,0, затем перемешивают с углем в течение 30 мин,уголь отфильтровывают. Фильтрат про О пускают через колонку с 150 мл катионита КУ-20 в Н Форме, колонку промывают водой, объединенные элюатынейтрализуют анионитом ЭДЭ, в ОНформе до рН 6,5-7,0. Нейтрализован ные элюаты упаривают при пониженномдавлении до небольшого объема, под"кисляют 10%-ной серной кислотой дорН 4,0-4,5, добавляют активированныйуголь, перемешивают 20 мин, после ЗО чего уголь отфильтровывают. Фильтратвыливают в 10-кратное количество метанола. Выпавший осадок сульфатасизомицина отфильтровывают Получаютоколо 20 г препарата с содержанием360 мкг/мг сизомицина основания(7,2 г в пересчете на основание сизомицина).Предлагаемый штамм Мь.сгошопозрогаЫзса чаг, з.зошусп чаг, поч. 15-72при Ферментации на одной из оптимальных сред позволяет получить 7,5-8,0г сизомицина сульфата, содержащегооколо 600 мкг/мг сизомицина основанияиз 50 л культуральной жидкости.