Способ получения -лизина

Номер патента: 722492

Авторы: Кендзи, Тамоцу, Тутому

ZIP архив

Текст

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Соввтскнк С оцнвлнетнчесингг Распублнк(Я) М. Кл. С 12 П 13/06 ГосударственныИ комитет СССР по делам изобретеннИ н открытиИ/ Дата опубликования ооисаиий 1503,80(72) Авторы Тутому Танака, Тамоцу Хиракава и Кендзи Такахара изобретений (Япония)Иностранная Фирмаф 1 КанегаФучи Кемикал Индастриз Ко, ЛТДфф (Япония)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ЛИЗИНА Изобретение относится к техникеполучения Ь-лизина Ферментацнеймикроорганизмов в культуральнойсреде, содержащей источник ассимилируемого микроорганизмом углерода,и может быть использовано в производстве кормов, пищевых продуктови Фармацевтических препаратов,Известен способ получения Ь-лизина путем выггащивания продуцирующихего микроорганизмов на питательнойсреде, содержащей источники углерода,.азота, неорганические соединениян стимуляторы роста с последующимвыделением Ь-лизина из культуральной гвжидкости одним иэ известных способов,например, при помощи ионообменнЫхсглол г 1), Известный способ не обеспечивает высокого выхода Ь-лизина.Целью изобретения являетсяувеличение выхода Ь-лизина, атакже получение лизина иэ углеводородов, как источника углерода, путем культивирования мутанта штаммамикроорганизма, принадлежащегок роду Ас 1 пегоЬасег,Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения Ь-лизинав качестве микробрганиэмов-продуцентов используют мутантные штаммы Ас 1 пе 1 оЬас 1 ег са 1 соасег 1 сцз АТСС31024, АТСС 31025 и АТСС 31028,полученные из штамма Ас 1 пе 1 оЬас 1 егса 1 соасес 1 сцз Р 38 АТСС 31023 предпочтительно ультраФиолетовым облучением.При этом штаммы являются устойчивыми в среде к более чем 0,05 Ь-треонина и Ь-валина, или более чем0,05 Ь-валина.Крогле того, штаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их аналогам, к комбинации аминокислот и иханалогов, при этом аминокислоты вы- бирают из группы, включающей треонии,валин, метионин, лизин и серии,а аналоги аминокислот выбирают изгруппы, включающей норвалин,-оксивалин, аг- -аминомасляную кислоту,А. -амино- Р -хлормасляную кислоту,Б-аминоэтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокисьметионина и гидроокись валина.При этом в качестве стимуляторароста Ь-лизина используют поверхностно-активное вещество.Способ осуществляют следующимобразом,Продуцирующие Ь-лизин микроорганизмы, в качестве которых используютмутантные штаммы Ас 1 пе 1.оЬас 1 егса 1 соасе 11 сцз АТСС 31024, АТСС 31025и АТСС 31028, полученные из штаммаАс 1 пе 1 оЬасег са 1 соасе 11 сцз Р 38 АТСС31023 ультрафиолетовым облучением,выращивают на питательной среде,содержащей источники углерода, азота,неорганические соли и стимуляторыроста,Культура АсЫеоЬас 1 ег са 1 соасе 1 сцз Р 38 может быть также обработана таким мутагенным агентом, какнитрозогуанидин (И-метил-И-нитро-И-нитрозогуанидин) или производнымизотиоциановой кислоты или подвергну"та адаптации.Адаптацию проводят путем культиви"рования родственных видов в культуральной среде, содержащей специфические аминокислоты или аналоги аминокислот,илп нх комбинации, такие аминокислоты, как например,треонин,валин,метионин,серии,лизин,или такие аналоги аминокислоткак р -гидроксинорвалин, ( -аминомасляная кислота, А-амино- р -хлормасляная кислота Я-амифЪноэтилцистеин,гидроокиси лизина,се- -3рина, метионина и валина.В качестве стимулятора роста 1.-лизина используют поверхностно-активное вещество, например полиоксиэтиленсорбитантриолет ТВИН от 0,01 до 0,5 3 Ов расчете на общее количество культуральной среды,Полученную культуру разбавляютсоответствующим образом, наносятее на агар чашки Петри и культивируют 3 Зштамм в течение 3-5 дней. В качествеисточников углерода используют н-параФин, органические кислоты, этаноли т.п,устойчивый к аминокислотам или иханалогам штамм подвергают далеемутагенной обработке или адаптациис применением других аминокислот,их аналогов или комбинаций для придания устойчивости против них.Штаммы являются устойчивыми в сре де к более чем 0,05 Ь-треонина иЬ-валина, или более чем 0,05 Ь-валинавШтаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их аналогам, к комби Онации аминокислот или к комбинациямаминокислот и их аналогов,Полученный штамм образует 1 -лизинпри аэробной культивации с применением н-парафинов, содержащих от 10до 20 атомов углерода в линейнойцепи, например керосин, газойль ит.п. Эти источники углерода применяют каждый в отдельности или вкомбинации из двух или более,В качестве источников азотаиспользуют органические и неорганические аммонийные соли, такие, каксульфат аммония хлористый аммоний,нитрат аммония, ацетат аммония,сукцинат аммония, мочеэину, аммиак. В качестве неорганических солейиспользуют фосфат калия, натрия,сульфат магния, железа, марганца,цинка, карбонат кальция и т.п,в количестве, обычно применяемомв гроцессах Ферментации.Показатель рН культуральной средыэа весь период культивирования подцерживают от 5,5 до 9,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0, путем добавления ионов аммония,Культивирование проводят при температуре .от 25 до 40 С, предпочтительно от 30 до 37 ОС, в аэробных условиях,например, при перемешивании с аэрацией или путем взбалтывания.По окончании культивирования образовавшиеся клетки извлекают изкультуральной среды например, фильтрованием или центрифугироэанием, припомощи ионообменных смол. В качествеионообменных смол используют, например,амберлит 1 ВС, 1 ВС, 1 ВС-50, Ионообменную смолу затем элюируют эодныч аммиаком, элюат концентрируют и нейтрализуют концентрированной соляной кислотой.Выделенный хлористоводородныйлизин высушивают, получая продуктчистотой более 98,П р и м е р 1, Взятый петлейплатиновой проволоки посевной материал Ас 1 пеоЬас 1 ег зр Р 38(АТСС31023) и родственные ему мутантныештаммы Ас 1 пе 1 оЬас 1 ег зр 938-15 (АТСС024), Ас 1 пе 1 оЬасег вр У 38-О(АТСС 31025) и Ас 1 петоЬас 1 ег зрР 38-20 (АТСС 31028) засевают в пробирку, содержащую 10 мл культуральной среды, состава, : пептон 1,мясной экстракт 1, дрожжевой экстракт 0,5, Среду предварительно стерилизуют в течение 15 мин при 120 фС,Культивирование производят втечение 24 ч при 38 С для полученияпосевной культуры, Две капли этойкультуры вносят в 10 мл среды пробирки и культивируют затем при33 С.1. Культуральная среда (контроль)содержит 15 мл этанола, 12 мл 75 ной фосфорной кислоты, б г сульфатааммония, а также содержит, мг:М 1 ЯО 7 НО 200; РеЯО 47 Н О 100;СаС 1 2 Н О 100; 2 пЯО 4 7 Н -О 30;14 пЯО4 НО 2; СиЯО 5 Н 0 0,5;ЧаОН 10 г водопроводная вода 1 л.2, Среда, содержащая треонин,Контрольная среда плюс 0,5 г/л треонина,3, Среда, содержащая валин.Контрольная среда плюс 0,5 г/л валина.Среды стерилизуют при 120 С в течение 15 мин перед посевом,Данные роста штаммоэ в каждойсреде приведены в таблице.Результаты таблицы показывают,что после 20 ч культивированияштамм 938-15 устойчив к треонинуи валину и штаммы ММ 38-19 и 38-20устойчивы к валину,Каждый из четырех штаммов засевают в косую среду, содержащуюн-парафины и соли, имеющую следующий состав, Ъ: н-С,- С,з-парафины0,8; сульфат аммония 0,6; К НРО 1,0;Мд 8047 НО 0,02; КН, РО 4 1,0; ОаС 1.0,1, ГеЯО 4 7 Н О 0,1; гп 80 7 Н 00,003; Мп 8044 НО 0,0003; агар 2;СаС 1Н ОКультивирование проводят 2 дняпри 33 С, рН 7,0, стерилизуют при120 С в течение 15 мин.Взятую петлей платиновой проволоки эту культуру засевают в 20 млуказанной среды, содержащейся в колбе Сакагучи на 500 мл и культивируют при 33 С в течение 10 дней.Среда для получения Ь-лизинаимеет следующий состав, %: н-С,-С,з-парафины 10; КНР 04 0,05; КНРО0,605; МАМБО 7 Н 0 0,05, Ге 804 7 НО0 001 2 п 8047 НО 0,001; МпБО4 НО0,001, ТВИН 85 0,1 у СаСО Зу (БН) ЯЯ3,5, 25Стерилизуют при 120"С в течение15 мин.По окончании культивирования содержание хлористоводородного Ь-лизина определяют микробиолОгической ЭДпробой, получая следующие данные:Применявшийся Количествоштамм, лизина,Р г/л 38 35 0,4 38-15 20,4 38-19 21,438-20 1,140П р и м е р 2. Штамм М 38-15 предварительно культивируют со взбалтыванием в среде из н-парафинов и неорганических солей косой культуры, какописано в примере 1, в течение 2дней при 33 СВзятую петлей .платиновой проволоки эту культуру засевают в 30 мл указанной среды, содержащейся в колбе Сакагучи, на500 мл, и затем культивируют совэбалтыванйем при 33 С один день.Среда посевной культуры имеетсостав, В: н-Сц - С -парафин 2;75-ная фосфорная кислота 1,2 (по.обЪему) 1 (ИН 43804 0,6; ИаС 1 0,1,Мд 804 7 НО 0,02, СаС 12 НО 0,01,; 55Ге 804. 7 НО 0,01; 2 пЯО 7 НО 0,003;Мп 804 4 НО О, 0002; ТВИН 85 0,05 уКОН 1, 4.Стерилизуют при 120 С в течениеЯ15 мин. 605 мл получившейся посевной культуры переводят в 200 мл среды,имеющей такой же состав и содержащейся в колбе Сакагучи на 2 л, икультивирование со взбалтыванием 65 продолжают один день при 33"С. Затем600 мл посевной культуры вносятв 19 л указанной ниже среды для получения Ь-лизина, содержащейся вферментере на 30 л, и культивируютпри взбалтывании, аэрировании соскоростью 27 л/мин, перемешиваниипри 500 об/мин, рН от 5 до 8 поддерживают водным аммиаком в течение72 ч.Среда для получения Ь-лизинаимеет следующий состав, Ъ: н-Сд - С,4-парафин 10; КНРО 0,05; КНРО0,04 у Мц 8047 НО 0,05; Ге 8047 НО00012 п 8047 НО 0001 Мп 804 4 НО0,001; ТВИН 85 0,1 Р (БН, ) 804 2 РСаСО 1,Стерилизуют при 120 С в течение15 мин.Количество образовавшегося Ь-лизина составляет 22 г/л культуральнойсреды, Затем 2 л этой среды центрифугируют для выделения клеток, отделенную жидкость пропускают черезколонку с ионообменной средой Амберлит 1 ВС, адсорбируя Ь-лизин насмоле. Колонку промывают водой иЬ-лизин элюируют разбавленным водным аммиаком Элюат концентрируют.рН доводят до 5,5 концентрированнойсоляной кислотой и после сушки получают 3 1,9 г хлористоводородногоЬ-лизина, имеющего чистоту более98,П р и м е р 3. Взятую петлейплатиновой проволоки бульонную косуюкультуру АсдпеоЬасСег яр У 38-15,которую перед этим культивируют втечение 2 дней при 33 С, используютдля посева в 20 мл среды в колбуСакагучи на 500 мл. Затем штамм культивируют при 33 С 4 дня на среде следующего состава,%: этанол (подаваемый порциями) 5; КНР 04 0,1; КН РО0,1; М 9804 7 НО 0,05;.Ге 8047 НО 0,001; Еп 8047 НО 0,001 р Мп 8044 Н О О, 001; ТВИН 85 0,1 у СаС 01 р (ИЙ ) 804 1.Стерилизуют при 120 С в течение 15 мин.По окончании культивирования определяют, что культуральная среда содержит 4,1 г Ь-лизина на 1 л.П р и м е р 4, Штамм Ас 1 пе 1 оЬастег яр 9 38-15 культивируют, как описано в примере 3, но в качестве источника углерода в среде используют вместо этанола уксусную кислоту.Микробиологическая проба показывает, что количество Ь-лизина составляет 3,7 г на 1 л культуральной среды.Предлагаемый способ полученияЬ-лизина по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход Ь-лизина и может быть использован для его промышленного получения,онтрольная онтрольная треонинов 2 Кон трольна я Ф валиновая онтрольная + треониновая+ онтрольная валиновая мула иэобретени Спо щийся устойчивыбпоп.1,.отлич аю тем, что штаммы являются в среде к более чем 60.5 В Составитель А. Бражников аедактор Л.Новожилова Техред М. Петко Коррект тяга 9/47 Тираж 522 ЦНИИПИ Государственного по делам изобретений 113035, Москва, Ж, 1 аушсПодписноеомитета СССРоткрытийая наб., д, 45 Эа илиал ППППатент , г, Ужгород, ул ктная,1.Способ получения Ь-лизина путемвыращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде,содержащей источники углерода,азота, неорганические соединениян стимуляторы роста с последующимвыделением Ь -лизина из культураль"ной жидкости одним иэ известныхспособов, предпочтительно при помощиионообменных смол, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в качестве микроорганизмов-продуцентов используют мутантные штаммы Ас 1 пеТоЬас 1 ег са 1 соасеЫсиэ АТСС 31024, АТСС 31025 и АТСС31028, полученные иэштамма Ас 1 пе 1 оЬасСег са 1 соасеЫсив 9 38 АТСС 31023предпочтительноультрафиолетовым 4 Ооблучением. Ь-треонина и Ь-валина, или болеечем 0,05, Ь-валина.3, Способ пр п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем что штаммы являютсяустойчивыми к аминокислотам или иханалогам, к комбинации аминокислот,или комбинации аминокислот и их аналогов, при этом аминокислоты выбирают из группы, включающей треонин,валин, метионин, лизин и серин, ааналоги аминокислот выбирают иэ группы, включающей норвалин, б -оксивалин, А -аминомасляная кислота,А -амино--хлормасляная кислота,Б-аииноэтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокисьметионина и гидроокись валина.4. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве стимулятора роста Ь-лизина используютповерхностно-активное вещество.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент СССР 92 ббб 49, кл,С 12 0 13/1 б, опублик, 1970,

Смотреть

Заявка

2054466, 06.08.1974

ТУТОМУ ТАНАКА, ТАМОЦУ ХИРАКАВА, КЕНДЗИ ТАКАХАРА

МПК / Метки

МПК: C12D 13/06

Метки: лизина

Опубликовано: 15.03.1980

Код ссылки

<a href="https://patents.su/4-722492-sposob-polucheniya-lizina.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения -лизина</a>

Похожие патенты