Способ получения ферментного препарата, обладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием

(51) Г 26 С 07 А 61 35/5 Государственный комнтв Соввтв Мнннстрав ССС оа деном нзобрвтвннй н открытой.77. Бюллетень4 5) Дата опубликования описания 17.11.77 ранцы,Штоккер (Швейцария),гарета Бломбэк и Биргит Хессел (Швеция) Иностранная фирмаПентафарм АГ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРА ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕМОСТАТИЧЕСКИМ И АНТИКОАГУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Изобретение относится к Фармакологической промышленности, а именно к производству лекарственных препаратов,Известен способ получения лекарственных препаратов из яда змей ВбЬгорь )агогаса иьи ЬасМые, а 1 го х, заключающийся, в том что. яд растворя" ют в дистиллированной воде и .выделяют две активные фракции путем последовательного осаждения сульфатом аммония и сульфатом. магния. Обе фракции раздельно диалйзуют.,Фракциюсодер" жащую токсины,":облучают светом квар" цевой лампы обе фракции раздельно растворяют в воде и растворы смешивают, добавляют к раствору хлористый" натрий и фенол и после отстаиванияфильтруют.Полученный ферментный препарат обладает способностью свертывать кровь,Предложенный способ получения фер" ментного препаратакобладающего гемостатическим и антикоагулирующим действием, заключается в том, что изотонический водный раствор яда змеи Во Нио р о о 1 г о х или яда с аналогичной иммунной реакцией с рН 4,5-7,0 подвергают фракционированию, например, сульфатом аммония, тепловой обработке при 30-50 фС и рН 3,030 Эдмунд Э.Перс, Курт(72) Авторыизобретения БиргерБломбэк, м 4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выделяют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой известными приемами.Способ осуществляют следующим образом.Высушенный посредством лиофильной сушки змеиный яд, например яд Ва 1 Ьгорн Мго , растворяют в Физиологическом растворе хлористого натрия при рН примерно 4,5-7,0. Нераст воренный материал удаляют из раствора центрифугированием или Фильтрованием.Прозрачный раствор яда доводят до слабокислого значения рН (примерно до 3/4) добавлением минеральной кислоты, например соляной, серной или уксусной, а затем нагревают при перемешивании так, чтобы произошло осаждение балластных белков без какой-либо потери активного вещества.Степень такого осаждения зависит от времени нагревания и температуры, а также от рН раствора. При рН 3 достаточно нескольких минут, например 10 мнн при 30 фС. При рН 3,5 время нагревания удлиняют до 1 час при 30 оС или до 30 мин при 40 фС.Осажденные белки отделяют центрифугированием. Доводят рН фильтра до 4,5-7,0 и подвергают фракционному осаждению соли с целью удаления сначала фракции балластных веществ а 5 затем для осаждения фракции активных веществ, Такое фракционное осаждение проводят аммониевыми солями или солями щелочных или щелочноэемельных металлов минеральных кислот, например хлоридом или сульфатом аммония, Если применять сульфат аммония, рН 6,5, то фракция балластных веществ осаждается при концентрации 40, а активная фракция при концентрации 55 (при 20 С). При использовании других солей, значений рН и температур осаждения необходимы различные концентрации насыщения. Активную фракцию выделяют из маточной жидкости центрифугированием и растворяют в дистиллированной воде. "ф Значение рН раствора доводят до 4-6. Активное вещество осаждается в виде комплекса добавлением примерно 7 вес.% фенола или производного фенола; можно также применять фенолформальдегидные М смолысодержащие свободные фенольные группы. Отделенный комплекс промывают несколько раз 0,1-0,5%-ным раствором 30 уксусной кислоты в полярном растворителе с целью разложения комплекса и растворения фенола или производного фенола, Комплекс, состоящий из активного вещества и Фенола или производ ного фенола, растворяют в воде при рН 7,5-8,5. Значение рН доводят до укаэанной величины добавлением гидро- окиси щелочного металла. Раствор фильтруют под давлением азота через 40 ультрафильтр с такими размерами отверстий, чтобы активное вещество (ферментный состав) оставалось на фильтре, а фенол или производные фенола проходили через фильтр в раство- ,ц ренном состоянии,Активное вещество, которое остается на фильтре, промывают несколькими порциями дистиллированной воды или раствора подходящего консерванта с целью удаления остатков фенола или производного фенола, Ферментный препарат, который оказывает в малых дозах гемостатическое действие, а в больших дозах - антикоагулянтное дей-ствие на кровь человека и других млекопитающих, имеет следующие свойства.Обладает тромбиноподобными свойствами эндопептидаэы. Он содержит пептидный компонент и углеводный компонент, причем пептидный компонент включает один или несколько полипептидов с молекулярным весом примерно от 18000 до 55000, определяемым по способу балансирования с применением ультрацентрифуги. 65 Препарат содержит углевод (саха)нейтрального характера) в количеств2-10 вес.В от белкового содержимогослабо растворим в физиологическомрастворе хлористого натрия, образуеткомплексы с фенолом и производнымифенола, слабо растворимые или нерастворимые в воде. Вызывает коагуляцию фибриногена путем избирательного удаления фибринопептидов А изфибриногена без освобождения фибринопептидов В. Ферментный препаратобладает тромбиноподобной активностью, соответствующей 30-450 ед. тромбина ( й 1 Н) на 1 мг белкового содержимого.Расщепляет метиловый эфир п-толуолсульфониларгинина и желатину, ноне расщепляет метиловый эфир лизина,этиловый эфир фенилаланинай -ацетилметионин, 11 -ацетилтиозин, лейцилглицин и казеин. Препарат не ингибируется гепарином, гепариноидами, гирудином, антитромбинами и ингибитроммноговалентной пептидаэы Кунитца. Онингибируется при концентрации фермента примерно 5 мг на 1 мл до содержания примерно 95% по отношению к егокоагуляции и при активности эстеразыв отношении 2,5 х 10 змолей диизопропилфторфосфата при рН 8 в течение2 час. Он полностью ингибируется метиловым эфиром п-толуолсульфониларгинина и полностью ингибируется антителами, содержащимися в сыворотке,не восприимчивой, к змеиному яду, онне фиксируется и поэтому не инактивируется фибрином.Препарат обладает в значительнойстепени более длительным временем полураэложения, чем гепарин. Он вызывает образование производного фибрина,который взаимодействует с избыткомфибриногена с образованием неполимериэуемого комплекса фибрина с фибри.ногеном. Он воздействует на фибриноген с образованием фибрина, которыйобладает физико-химическими свойствами, отличающимися от свойства фибрина,полученного из тромбина, так как онбыстро гидролизуется фибринолитическими ферментами, например плаэмином,даже в присутствии активированногофактора Х 11 и ионов кальция и растворим в 5 М водном растворе мочевины ивызывает аУ(90 дефибриногенирование и фибринолиз без побочного геморрагического и тромбоэмболическогодействия,Ферментные составы можно применятьв качестве реагента и вспомогательного средства для физиологического изучения свертывания крови ,(а 9 йто, на.пример, для исследования превращенифибриногена в фибрин в присутствиигепарина и антитромбинов для исследований с фибринопептидами для изупения наголо ических фибрннных :груктур, продуктов разложения Фибриногена, фактора УИ и фактора Х)ППри назначении в умеренных дозах п чиччо ферментный состав вызывает уменьшение кровотечения и времени свертывания крони у экспериментальных кивотных, а также у бопьных с нормальным или патологическим состоянием свертывания крови . При внутреннем нве-(0 дении здоровым люлям в умеренных дозах Ферментный препарат вызывает образование растворимых комплексов Фибрина с фибриногеном в токе крови, о чем свидетельствуют положительные пробы на криофибрин и паракоагуляцию в плазме, а также К -терминальный анализ Фракций плазмы пациентов, Поэтому предложенный ферментный состав можно применять н качестве кровоостанавливающего средства.При назначении нового Ферментного состава н повышенных дозах собакам наблюдается быстрое дефибриногенирование, а также связанный с этим фибринопиэ и появление продуктов разложения Фибриногена (ПРф) в крови, Дефибриногенирование и Фибринолиз имеют место без каких-либо симптомов шока, без тромбоцитопении и без тромбических и геморрагических нарушений,80 Клинические испытания больных с тромбозом вен голени или вен сетчатки показали, что ферментный состав особенно применим для лечения, сопровождающегося дефибриногенирующим и фибрино литическим действием.В очищенном состоянии ферментный состав легко растворим в разбавленных растворах солей, но ",.лабо растворим в дистиллированной воде. Его можно 40 осаждать из водных растворов солями или органическими растворителями, смешивающимися с водой, можно обратимо фиксировать на иокообменных смолах основного характера и можно получить 45 водонерастворимые комплексы с фенолом и его производными.Он характеризуется высокой термостойкостью и заметной устойчивостью к кислотам. В качестве кровоостанав ливающего средства ферментный препарат данного изобретения можно назначать в суточных дозах, примерно 0,25/ /1,4 ед. К 1 Н на 60 кг веса тела.В качестве антикоагупянта для крови Ферментный состав можно применять в суточных дозах примерно 7-14 ед, й 1 Н на 60 кг веса тела. П р и м е р 1, 20 г змеиного яда вида Ьо 1,Ьгорь Мгок растворяют н 1000 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия, а затем центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Осадок удаляют, Доводят значение рН центрифугата до 3,5 разбавленной уксусной кислотой, нагревают при 30 фС н теение 1 час на водяной бане, а затем снова центрифугируют. Остаток удаляют, доводят значение рН центрифугата до 6,5 едким натром и объем раствора доводят до 1000 оп 0,95-ным раствором хлористого натрия, К этому расвору добавляют при перемешивании 670 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 час, а затем полученный осадок отделяют центрифугиронанием. К центрифугату добавляют еще 552 мп насыщенного раствора сульфата аммония и через 1 час смесь снова центрифугируют. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят рН раствора до 5,0 разбавленной уксусной кислотой, к раствору добавляют 7,7 мл 90-ного фенола при перемешивании. Смесь выдерживают н течение 15 час при комнатной температуре, Затем осажденный Фермент отделяют центрифугированием. Центрифуат отбрасывают, Осадок промывают дважды по 10 мп воды, насыщенной фенолом, отделяют центрифугированием и обрабатывают 50 мл этанола, содержащего 1 уксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 1 час, а затем Фильтруют через стеклянный ва:уум - фильтр, Выделенное вещество промывают несколькими порциями по 20 мп этанола и высушивают под вакуумом,Получают 2-2,5 г Ферментного состава (степень чистоты 1), обладающего тромбиноподобным действием (примерно 10 - 12 .д. на 1 мг сухого вещества).11 олученный продукт обладает стойкостью при хранении. Неочищенный фермент обрабатывают 40 мп трис-Фосфатного буфера (рН 6,0) и перемешивают в течение 15 мин. Не- растворившуюся часть удаляют иэ раствора центрифугированием. Прозрачный центрифугат заливают со скоростью 0,8-1,0 мл/мин в колонну, наполненную 200 мл ДЭАЭ-сефадексом, нейтрализонанного трис-фосфатным буфером, а затем элюируют 800 мл того же буФерного раствора, Первый элюат отбрасывают, фермент элюируют 4400 мл трис-фосфатным буфером (0,04 моля). Активный элюат иэнлекают и концентрируют на ультрафильтре УИ(Амикон) под давлением и прбчынают до полного отсутствия солей. Концентрат, не содержащий солей, высушивают под вакуумом над фосфорным ангидридом или подвергают лиофильиой сушке, Получают 200-250 мг фермент- ного состава со степенью чистоты И обладающего активностью 100-150 ед. Й 1 Н тромбина на 1 мг белкового содержимого.581872 Формула изобретения Составитель С.Малютина Редакко А. Бе текоелК,Леакцкак Ко екто П. МакаревичЗаказ 3941/3 Тираж 553 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 44 ЗЛ, Цоокаа а-За аакиокак иаа, 44 к 4Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Концентрат, не содержащий солей, затем концентрируют до 5 мл на ультрафильтре. Раствор фильтруют через стеклянный вакуум-фильтр пористостью Яс целью удаления каких-либо пылевидных частиц. Прозрачный раствор выдерживают в течение не менее 24 час в холодильнике при 2 фС. Ферментный состав выделяют в виде прямоугольных кристаллов. Полученные кристаллы выделяют центрифугированием при 0-2 фС, промывают несколько раэ по 0,5 мл дистиллированной водой при охлаждении льдом, а затем высушивают над фосфорным ангидридом. Получают 45 мл бес - цветного фермента, активность которого составляет 150-200 ед, тромбина ( И 1 Я ) на 1 мг белкового содержимогоП р и м е р 2. Колонну загружают Сефадексом 3-100. Гель Сефадекса нейтрализуют 10-ным водным раствором уксусной кислоты. 6,26 мг ферментного состава, полученного по примеру 1 (степень чистоты П ) растворяют в 03 мл 10-ного водного раствора уксусной кислоты. Раствор заливают через колонну, Водный 10-ный раствор уксусной ксилоты пропускают через ко лонку снизу со скоростью 5,6 мл в 1 час.Образуются зоны поглощения ультра фиолетовых лучей (280 мл). Элюат, полученный из первой эоны, подвергают лиофильной сушке и получают 4,25 мг ферментного состава с активностью 200-250 ед. ( МИАН ) тромбина на 1 мг белкового содержимого. Способ получения ферментного препарата, обладающего 4 гемостатическим и антикоагулирующим действием, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что изотонический водный раствор яда змеи Ва 1.Лер Мгах или яда с аналогичной иммунной реакцией с рН 4,5- 7,0 подвергают фракционированию, например, сульфатом аммония, тепловой обработке при 30-50 фС и РН 3,0-4,0, частично очищенный раствор обрабатывают фенолом или производными фенола и выделяют целевой продукт из комплекса с последующей очисткой известными приемами.