1 -и -дезокси -рибофуранозиды 5 триметилсилилурацила, проявляющие противовирусную активность

(57-с и4 ы 5-триме1 и 11О 81(СН)Н НО проявлность 3 Х 7 юДни косм заавкения ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Онкологический научный центрАМН СССР, НовОсибирский институторганической химии СО АН СССР, Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов и Московский научно-исследовательский институтглазных болезней им, Гельмгольца/Ь-Дезокси-Р-рибофуранозиилсилилурацила, формулы ие противовирусную актив- ф)Ьг0 П актив проявляющим противовирусную 15ностьИзвестно нрименение 5-иод-деэоксиуридина для лечения вирусныхзаболеваний герпЕтической этиологии Г 13.Цель изобретения- новыехимические соединения: 1-о- и р-деэокси-В-рибофураноэиды 5-триметилсилилурацила, проявляющие противовирусную активность и расширяющие арсеналсредств воздействияна живой органйзи - достигается путем синтеза данных соединений, основанного на известной реакции конденсации триметилсилильных производных урацилас ацилгалогенозой(,23.Способ получения 1-о 5- и 6-дезокси,-О-рибофуранозидов 5-триметилсилилурацила обычно осуществляют превращеНией 5-триметилсилилурацила в бис-О-триметилсилильное производное дейст вием гексаметилдисилазана, с последующей Конденсацией полученного бис-О-триметилсилильного производного 5-трйметилсилилурацила с 2-дезокси,5-ди-О-и-толуил0-рибофураноэилхлоридом в присутствии 5 пС 14, снятиемзащитных групп метилатом натрия иразделением изомеров тонкослойнойхроматографией обычными приемами.П р и м е р 1 с и Д дезокси 0 45-рибофуранозиды 5-триметилсилилурацила.Смесь,состоящую иэ 3 г (16 3 ммоль).5-триметилсилилурацила, 3 мг сульфа- "та аммония и 12 мл гексаметилдисила-,эана, кипятят в течение 11 ч. Избыток гексаметилдисилаэана отгоняют ввакууме, остаток растворяют в 12 млбезводного дихлорэтана и прибавляютк суспензии 5 .г (12,9 ммоль) 2-деэок.си,5-ди-б-п-толуил-д;Р-рибофурано.зилхлорида и 0,5 мл (4,2 ммоль) ЯпС 14В 12 мл безводного дихлорэтана.Реакционную массу перемешивают 4 .ч при20-220 С, затем промывают последовательно насыщенным раствором бикарбо" 60ната натрия (2 х 5 мл) и водой. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток , хроматографируют на пластинах (20 х х 20 см) с сипикагелем ЛСЛ 5-40 мкм .(СЬешвр 01, ЧССР) в системе хлороформ метанол (10:1), собирая фракцию сВ О,б. Получают 3,5 г (50,7 Ъ) 2-дезокси,5-ди-О-п-толуил-Р-рибофу( /раноэнл-триметилсилилурацила. Кполученному веществу прибавляют100 мл 0,1 н раствора метилата натрия в метаноле, через 2 ч реакциойную массу нейтрализуют ионообменнойсмолой ДауэксЧх 8 (Нф) до рН 7 поуниверсальному индикатору, смолу отделяют, растворитель отгоняют в вакууме, остаток (2,56 г) хроматографируют на пластинах с силикагелемв системе этилацетат-метанол (91)при двухкратном пропускании системырастворителей через пластину.Иэ зоны с большей подвижностьювыделяют 0,87 г (44,4 Ъ) 1-9-В-дезоксирибоэида 5-.триметилсилилурацила ст,пл, 60-62 СИ 2 е+9,9(с 1, спирт).УФ-спектр (96 Ъ-йый спирт):м,кс265 нм, б 9060, ПМР (СР ОР, ТМС) .7,84 м.д,. (Н 6)ф 6,31 м.д, (НУгс6,6 Гц), 4,42 м.д. (Нэс), 3,96 м.д.(2 Н с), 0,21 м.д. (Ме Я 1).найдено, Ъ: С 47,0; Н 6,59;Б 9,48; Я 3. 8,97.Сс 2 Н 2 ойдОЯ 11/3 НО.Вычислено, Ъ С 47,03; Н 6,80;Б 9,14; Я 1 9,17.Йэ зоны с меньшей хроматографической подвижностью выделяют 0,79 г(Н 2 и Н 2 Ъ д 7 эсб Гцс Юг 33 Гц Уин15 Гц), 0,23 м.д. (Ме 3 Яь ),Найдено, Ъ: С 46,6; Н 6,50;Б 9,47; Я 8,98.С Н 2 Л О Я 1 1/3 Н 20Вйчислейо, Ъ: С 47,03; Н 6,80;Б 9,14; Я 9,17.Определение противовирусной активности,Противовирусная активность ин витро 1-еи -дезокси-рибофуранозидов5-триметилсилилурацилас определяют последующей методикеКультуры куриныхфибробластов в дозе 10 мл вносят в100-граммовые матрицы. Повицкой, Через48 ч при образовании сплошного монослоя культуры инфицируют вирусом герпеса простого типа 1 или осповакциныс множественностью от 0,01 до 1 ЦПД 0на клетку. После одночасовой инкуба"ции монослой трижды промывают средой199 и вносят препарат в дозах от 32до 250 мкг/мл, матрицы помещают при37 С на 18-20 ч. Каждую дозу препарата и каждую дозу вируса испытываютв двух матрицах. В качестве контроля.Продолжение табл, 1 служат: а) два матраца с клеточнымикультурами, инфицированными вирусом,но не обработанные препаратом, б) дваматраца, в которые вносят препарат,но культуры не инфицируют вирусом(контроль токсичности препарата). Череэ 18-20 ч после инфицирования кульУтуры просматривают под микроскопом итрижды замораживают на сухом льду,После последнего оттаивания материалцентрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 мин, Затем методом титрова 1 ния на однослойных культурах куриныхфибробластов определяют в надосадочной жидкости урожай вируса в опытныхи контрольных культурах. Из испытуемых материалов готовят десятикратныеразведения на среде 199 и вносят по1 мл в пробирки с куриными фибробластами. Пробирки инкубируют при 37 Сов течение 5 дней и учитывают результаты по цитопатическому действию,При описанных условиях постановкиэксперимента урожай вируса герпесав контрольных культурах составляет10-107 ЦПД о/мл а вируса осповакцины - 10 Юь , При,внесении эаяв 25ленных препаратов урожай вируса взависимости от дозы препарата и инфицирующей дозы вируса снижается на2-5 лг ЦПД бо . Препараты оказывают нетолько профилактическое, но и лечеб- ЗОное действие. Выраженной профилактической и лечебной эффективностью обладают дозы 62 мкг/мл и более.Тимидин снимал ингибирующее действие описанных соединений при внесенин в клеточные культуры в эквимолярных концентрациях, что приводилок полному восстановлению репродукциивируса герпеса,Описанные соединения не являютсятоксичными для клеток, поскольку онине вызывали видимых цитопатическихизменений в неинфицированных клеткахпри 7-дневном наблюдении, При внутрибрюшинной инъекции мышам ЛДопрепара та составляла более 400 мг/кг весаживотного.Данные о противовирусной активности заявляемых препаратов приведеныв табл. 1, 2 и 3. 0,01 250 10 10 .10 125 62 Число ЦПД ,ингибируемых препаратом Множественность инфицированияв цпд 5 о/клетку Доза препарата,мкг/мл 10 10 250 0,1 125 1031010 250 0,01 125 62 Число ЦПД 50ингибируемыхпрепаратом Множественность инфицирования в ЦПД /клет- ку Доза препарата,мкг/мп 102 10 102 125-250 150Р 250 Таблица 1 62-125 31 не ингибирует Лечебную эффективность о -деэоксирибоэида ин витро определяли по следующей методике, Культуры куриных О фибробластов инфицируют вирусом простого герпеса с множественностью .0,1 ЦПД на клетку. Через 4 ч инку - 1 бации культуры трижды промывают сре199 ивносят препарат в дозе 250 мкг/м Далее опыт проводят по описанной дойл,125-25 250 Ингибирующее действие 1-о-дезокси-Э- -рибофуранозида 5-триметилсилилурацила (о-дезоксирибозида) на вирус герпеса при внесении в клеточные культуры через 1 ч после инфицирования. / Таблица 2 Ингибирукщее действие о -деэоксирибо 1 зида на вирус осповакцины при внесении в клеточные культуры через 1 ч после их заражения Таблица 3 Ингибирующее действие 1дезоксн-в-рибофуранозида 5-триметилсилидурацила ф-дезоксирибозида) на вирус простого герпеса при внесении в клеточные культуры через 1 ч после их заражения671287 Редактор П, ГорьковаТехред В,Далекорей КорректоРИ, Эрдейи Заказ 8036/2 Тираж 387Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 выл методике. Урожай вируса в, контрольных культурах составляет 10 ЦПД 6 о/мл, а в культурах, обработанных препаратом, он равен 1 ОЗЦПДзо(мл т.е. препарат ингибировал урожай вируса на 4 лг ЦПД,/мл.5 Способность тимидина снимать ингибирующее действие с -дезоксирибозида определяют по следующей методике Клеточные культуры заражают вырусом 10 герпеса с множественностью 0,1 ЦПД 50 на клетку, после одночасовой инкуба- ции монослой трижды промывают раствором Хенкса и внооят в клеточную куль" туру последовательно а-дезоксирибоцид 5 и тимидин в эквимолярйых концентрациях (по 250 мкг/мл)Эквимолярные.концентрации тимидина практически полностью снимают ингибирующий эффект препарата, что приводит к полному восстановлению репродукции вируса герпеса до 10." ЦНД/мл.,.Учитывая высокую противовирусную активность о -дезоксирибозида ин витро, была исследована его терапевтическая эффективность ин витро,при экспериментальном герептическом кератите кроликов.Препарат применялся в виде инстил ляций 6 раз в сутки водного раствора ЗО в 0,5 Ъ-ной концентрации. Предвари-, тельно в течение 10 дней изучалась переносимость 0,5 Ъ-ного раствора препарата тканями глаз кроликов. Токсико. аллергических осложнений не наблюдалосьИзучение терапевтической эффективности препарата проведено на 10 кро. ликах. Из них 5 были контрольными, которыми 6 раз и сутки проводилась инстилляция дистиллированной водИ,", Заражение осуществляют по общепринятой методике путем скарификации роговицы и внесения в конъюктивальную полость глаз кроликов. Лечение начиналось на 5 сутки от момента заражения, когда развивалась типичная картина герпетического точечного кератита. Об эффективности препарата судили по степени снижения индекса тяжести герпетического кератита в баллах в опытной группе по сравнению с контрольной.На чертеже представлены результаты исследования. Как видно из чертежа, уже на вторые сутки от начала лечения отмечается задержка процесса в опытной группе и прогрессирование в контрольной. В последующие сутки разница между леченными и контрольными глазами возрастает.Таким образом, экспериментальные данные указывают на выраженное противовирусное действие с-и р-деэоксирибозидов, при сравнительно низкой токсичности.