Способ получения тромборезистентных полимерных материалов

ь,аИЗОБРЕТЕН Ия Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ц 1665639(51)М, Кл. С 07 О 7/02С 08 Р 12/08 3 Ьоударотвонный комитат СССР во делам изобретений н открытий(72) Авторы изобретения Московский ордена Ленина и ордена Трудового КрасногоЗнамени государственный университет им, М, В, Ломоносова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ 1Изобретение относится к способу получения тромборезистентных полимерныхматериалов, которые применяют в меди,цине для создания искусственных крове-носных сосудовразличных деталей, вживляемых в организм искуственных орга- фнов, катетеров и деталей аппаратов "искусственное сердце" и фискусственное"легкоеф,Известен способ создания тромборе-10зистентных полимерных материалов регулированием гидрофильности или гидрофобности поверхности таких материалов,а также модификацией полимерных поверхностей природным антикоагулянтом кровй-гепарином 1,.Кроме того йзвестен способ получениятромборезистентных йолимерных материалов иммЬбилизацией на поверхности материалов фибринолитических и протеолитических ферментов, способных не только предотвращать образование тромба,но и гидролизовать фибрин с образованием растворимых продуктов 23 Поверх 2ность искусственных кровеноснйх сосу- дов"на- основе поликарбоната, поли- метилметакрилата и полйвннилхлорида сначала покрывают слоем графита, а затем на графит сорбируют урокинаэу, Для предотвращения быстрого вымывания фермента с поверхности полимера под действием тока крови урокиназу дополнительно сшивают глутаровым альдеги-дом,Однако для этого способа характерны отсутствие химической связи между молекулами фермента и полимерного материала, вследствие чего возможна десорбция фермента с поверхности полимера; отсутствие прямого действия урокинаэы на фибрин (урокиназа, как и другие фибрино литическне ферменты, лишь активирует аревращение присутствующего в организ ме неактивного профибринолизина в фиб ринолизин фермент, катализирующий растворение тромба) и достаточно высо- кая протеолитическая активность урокинаэы, вследствие чего возможно раствоз 6656 рение шва между искусственным и естественным органом под действием этого фермента.Цель изобретения - повышение тромборезистентной и фибринолитической активности и стабильности полимерного материала. 50 Это достигается за счет химической иммобилизации на поверхности предварительно 1.0озонированного полимерного материала, ацйлированного ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитического фермента микробного происхождения, выделенного из 05АсМеоиьсеь ь/4 егоМеь,шт. 1,Иммобилизацию проводят в присутствии ненасыщенного гидрофильного мономера под действием инициатора радикальной полимеризации.20Реакцию озонирования полимерного материала проводят обычным образом прио0-100 С пРопусканием над поверхностью обезжиренного материала озонасо скоростью 3-7 л/ч. Реакцию.иммобили 25зации фермента на поверхность озонированного полимера проводят растворениемацилированного фермента обычно в буферном растворе (рН 7,0 - 9,0) до концентрации 0,5-10 мг/мл с последующим30растворением в том же растворе гидрофильного мономера до концентрации1-э 00 мг/мл, погружением в полученныйраствор озонированного полимера и воздействием на реакционную смесь инициатором радикальной полимеризации, Реакцию иммобилизации проводят предпочтительно при 0-60 С в вакууме или воатмосфере инертного газа, например ар 40гона или азота, Весовое соотношениеацилированный фермент; гидрофильныймономер 1;50-ЗОО. В качестве исходного полимерного материала используютполиэтилен, полипропилен, полистирол, поли 45метилметакрилат, сложные полиэфиры и т.п.,в качестве гидрофильного мономера акриламид, метакриламидь оксиэтилметакрилат и т.д ь а в качестве инициатора по-.лимеризации вещественные инициаторы,например динитрил бисазоизомаслянойкислоты и рибофлавин, а также УФ-излучение,Ацилированный фермент получают, добавляя к раствору фермента с конценратцией 0,5-10 мг/мл ангидрид или хлорангидрид акриловой или метакриловойкислоты обычно при рН 7,0 - 9,0, тем-..пературе 0-60 С и мольном соотношеши 39 4фермент:ангидрид или хлорангидрид 1:10500,Основной отличительный признак изобретения - используемый фибринолитическийфермент. Условия проведения процессаиммобилизации фермента (рН, температура и соотношения реагентов) полностьюобусловлены ,физико-химический и биологической природой самого ферментаи полимерного носителя,и могут изме.няться в довольно широких пределах.П р и м е р 1. Ацилирование фермента проводят при 0 С добавлением краствору 50 мг фермента в 50 мл би-,карбонатного буфера (рН 8,0) 0,05 гхлорангидрида акриловой кислоты. Затемперемешивают в течение 15 мин и краствору добавляют 4 г акриламида. Озонирование полипропиленовой пленки толщиной 0,05 мм и площадью 10 смпрооводят при 20 С, пропуская над ьповерхностью обезжиренной пиэтиловым эфиромпленки озона со скоростью 7 л/ч в течение 4Озощрованную пленку помещают в раствор ацилированного ферментаи акриламида, Раствор вакуумируют до-Я10 - мм ртст. и облучают УФ-светом втечение 2 ч., Облученную пленку промывают бикарбонатным буфером. Активностьполученной пленки при использовании вкачестве субстрата 1%-ного раствора казеина 9,3+0,2 мкг тирозина/мин, Привнесении пленки на поверхность сформировавшегося сгустка,фибрина зона растворимости образуется в течение 8 мин. Придобавлении тромбина к раствору фибринОгена, нанесенному на поверхность полученной пленки, фибрин не образуется. Пленка с иммобилизованным ферментом хранится в течение 1 мес, при 20 С, полопостыл сохраняя свою активность, а прихранении в течение 1,5 мес теряет около 30 % исходной активности.Пр и м е р 2. Стадию ацилированияьозонирования и иммобилизации проводятпо примеру 1, облучая озонированнуюпленку в растворе ацилированного фермента и акриламида в течение 3 ч, Активность пленки по отношению к казенну11 ь 310 ь 2 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фибрина образуется в течение7 мин, Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит,П р и м е р 3, Стадию ацилированияь ОзонировапиЯ и иммобилизации проводят ло примеру 1, облучал озонирован45 ную пленку в растворе ацилированногофермента и акриламида, к которому предварительно добавляют инициатор полимеризации - рибофлавин в количестве10 мг/л, в течение 3 ч, Активность5пленки по отношению к казеину 26,3+0,3мкг тирозина/мин. Зона растворимостипри внесении пленки на поверхность фибрина образуется в течение 5 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленкине происходит.П р и м е р 4, Ацилирование ферменота проводят при 5 С добавлением к. раствору 20 мг фермента в 10 мл бикарбонатного буфера (рН 7,5) 0,05 г хлорангидрида метакриловой кислоты. В качестве полимера используют полиэтиленовую пленку толщиной 0,08 мм и площадью 10, см а в качестве гидрофильного мономера 2 г оксиэтилметакрилата. Стадию озонирования и иммобилизации проводят ло примеру 1. Активностьпленки по отношению к казенну 10,1-"+О0,2 мкг тирозина/мин, Фибринолитичес 25кая активность пленки аналогична активности пленки, полученной в примере 1,П р и м е р 5, Получ.ение тромборе-зистентного полимера проводят по примеру 2, используя в качестве ацилируощего агента ангидрид акриловой кислоты.Свойства материала аналогичны свойствамматериала, полученного в примере 2,П р и м е р 6, Получение тромборезистентногополимера проводят попримеру 3, используя в качестве полимера плотную .ткань из полиэтилентерефталата, а в качестве гидрофильногомономера 1 г метакриламида. Активность40полученного материала ло отношению кказенну 200+0,3 мкг тирозина/мин5 см 1 Фибринолитическая активностьткани аналогична активности пленки, полученной в примере 3,П р и м е р 7, Ацилирование фермента проводят лри 20 С добавлениемк раствору 100 мг фермента в 10 млфосфатного буфера (рН 7,0) 0,002 гхлорангидрида акриловой кислоты. Пос 50ле добавления хлорангидрида растворперемешивают в течение 10 мин и к рас-твору добавляют 5 г акриламида, Озонирование пластины из лолиметилметакрилата толщиной 3 мм и диаметром5550 мм проводят лри 100 С, пропускаянад обезжиренной поверхностью пластины озон со,скоростью 3 л/ч в течение30 мин, Озонированную пластину ломешают в раствор ацилировалного фермента и акриламида. Раствор вакуумируют"3до 5 10 мм рт,ст, и облучают УФ-свеотом 30 мин при 60 С, Активность полученной пластины при использовании вкачестве субстрата казенка 18,6+0,3 мкгтирозина/мин. Зона растворимости привнесении пластины на поверхность фибринаобразуется в течение 13 мин, Превращение фибриногена в фибрин под действиемтромбина на поверхности пластины непроисходит,, П р и м е р 8. Ацилирование фермента проводят лри 60 С, добавляя кораствору 10 мг фермента в 20 мл боратного буфера (рН О,О) 0,012 г хлорйнгидрида акриловой кислоты. Сразу последобавления хлорангидрида к раствору добавляют, 0,02 г акриламида, Озонирование полилролиленовой пленки проводятопри 0 С, пропуская озон со скоростью5 л/ч в течение 20 ч, Озонированнуюпленку толщиной 0,1 мм и площадью210 см и инициатор полимеризации -рибофлавин в концентрации 15 мг/л помещают в раствор ацилированного фермента и акриламнда и раствор вакуумируют до 10 мм рт,ст, Раствор облучаютвидимым светом (лампа накаливаниямощностью 250 Вт) 6 ч при О С, Активность полученной пленки 13,7 Ю,З мкгтлрозина/мин, Зона растворимости привнесении пленки на поверхность фибринаобразуется за 7 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит,Из рассмотренных примеров видно,что по предлагаемому способу получаютстабильные тромборезистелтные полимеры, которые не только предотвращаютобразование тромба, но и каталнзируютрастворение уже сформировавшегосясгустка фибрина без привлечения внутренних ресурсов орагнизма, То есть в данном случае эффект тромборезистентностиобусловлен не активацией -лрофибринолизина, а непосредственным воздействиемиммобилизованного, фермента на процессы тромбообразовяния и фибринолиза.Дополнительный вклад в повышение гемосовместимости вносит гидрофнлизацияповерхности полимерного материала засчет привитой сололимеризяции гидрофильного мономера в процессе иммобилизации фермента,Формула изобретения1. Способ получения тромборезистентных полимерных материалов иммобилиза65639 Составитель Г. КонноваТехред Н. Бабурка Корректор Ю, Макаренко Редактор Л. Письман Подписное Заказ 7670/1 Тираж 513ЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП фПвтентф, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 7 . 6 цией на их поверхности ферментов, отличающийся тем,что,с целью повышеййя тромборезистентной и фибринолитической активности и стабильности полимерного материала, лолимерный материал предварительно озонируют и иммобилизацию проводят в присутствии гидрофильного ненасыщенного мономера под действием инициатора радикальной полимеризации, а в качестве: фермента используют ацилированный ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитический фермент, выделенный из Ас 11 иовиаеа зфвгоЫвь шт. 1.2, Способ по п.1, о т л и ч а юш и й с я тем, что в качестве исходного полимерного материала используют полиатилен, полипропилен, полистирол, полиметилметакрилат, сложные полиафиры.3, Способ по п.1, о т л и ч а ю- Ф и й с я тем, что в качестве гидро фильного ненасыщенного мономера используют акриламип, метакриламнд, оксиатилметакрилат,4, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве инициатора полимеризации используют вещественные инициаторы, например динитрилбисазоизомасляной кислоты или рибофлавин, или Уф-езлучение,105, Способ по п.п. 1-4, о т л ич а ю щ и й с я тем, что процесс им"мобилизации осуществляют при 0-60 С,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.боФОТромборезистентные материалы.Ткань, Авег. Вос. АОИсиое 3 оЪег Ис 36. ОгДОМ10,213, 19642.Коьбегою.К,Хаггоа йъ.,МсЬайЯх.20 Синтетическая поверхность, покрытая ковале итие сшитой урокиназой,ТгамасМои Авеисаи боса ХогАг 11 Исайп 1 ю йц 1 Оап 5,19,"8,91