Способ получения стойких гликопептидных антибиотиков

Союз Советских Социалистииеских Республик.08,72 (21) 1819085/23-4 Кл,2 110 32) 13.08.7 13) Япония Государственный комите Совета Министров СССР по делам изобретений о 25 53) УДК 547.964,4.0 (088.8) 05.76. Бюллетень1ния описания 26.07.77 и открыти 5) Дата опублико 72) Авторы изобретени Иностранцыамао Юмезава, Томохнсо Такита,(Японит) хико Мураока и Акио фудз Иностранная фирма1) Заявите енкую Кои" Изобретение отспособу получения осится к новому химическому тойких гликопептидных антирименяются в медицине.биологический способ полуряда блеомицина неполной обычно при 0.50 С. В качестве окислителей обычноиспользуют феррицианид калия или двуокись мар.ганца, а в качестве исходного продукта - неочищен.ную смесь, содержащую соединения неполнойструктуры 1, например флеомицин, УА-. 56, зарба.мицин. Выделяют целевые продукты известнымиприемалпт, Идентифицируют полученные продуктыпрн помощи Уф-спектров поглощения. Гликопеп.тидные антибиотики неполной структуры П имеютспектр поглощения Уф-лучей с максимумамито 1 оьпоглощения Е 140.160 при 244 ммкм и Е50-60 при 300 ммкм, Глнкопептидные антибиотикинеполной структуры П имеют спектр поглощеният /оУф лучей с максимумами поглощения Е т стф/о120-135 примерно при 293 ммкм и Е, 150-170примерно при.244 ммкм. отиков, которыеИзвестен мик ния антибиотик труктуры-СО-МН Недоста чается в том, что при тов рода 5 тгертоются и нестойкие этого метода закл птн мик роор гани ллельно продуции неполной структу спользова гттусеа пара антибиотик 5 Оба, антибиотикмаксимума поглош имеют соответственно два ния. Однако соотношение бо.максимума поглощения к более лее длипнои волны короткой волне ма примерно 2,8 для т ю 1,2 для второго ния нестойких Предлагает сликопептидных способ прев мума поглоше составляет но пример. й рвого антибиотитибиотика,биотиков,полной стр нтибиотик ант примени уктурь 1 Пнеполной тоим антибиотикам не Преимушеством данного способа является зна. тельное повышение выхода очиптенного пропук а возможность выделения стойких антибиотиков. трук. тики гликопеп ые ися в том 111 полне то ан туры 1, заключаюш неполной струк ту гают окислени(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТОЙКИХ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИК3П р и м е р 1. Используют флеомицнн О, (медьсодержащий хлоргидрат) с максимумом поглощения Е147 при 244 ммкм и другим1 см 1 ф/омаксимумом поглощения Ес 54 при 300 ммкм в метаноле, 20 мг порошкообразного флеомицина О, растворяют в 1 мл воды и в растворе суспенди. руют 20 мг двуокиси марганца. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 40 час при перемешивании, После реакции суспенэию фильтруют и фильтрат пропускают через колонну, заполненную смолой "СМ - Сефадекс С.25", предварительно обработанной 0,05 М раствором хлористого натрия для абсорбции продукта реакции. Затем концентрацию раствора хлористого натрия, приме. няемого в качестве элюата, линейно повышают от 0,05 до 1 М для элюирования продукта реакции. В результате элюируют непрореагировавший флеоми. цин О, )во фракции, элюированной 0,40 М раствором хлористого натрия, а продукт реакции блеомицина Вз злюируют во фракции, элюированной 0,44 М раствором хлористого натрия. Последнюю фракцию пропускают через колонну, заполненную 1 мл активного угля, что приводит к адсорбирова. нию блеомицинаВз, Затем продукт промывают водой для удаления неорганических солей и элюируют смесью 0,02 н.раствора соляной кислоты с ацетоном (1:1) и элюат пропускают через продукт, что приводит к элюированию раствора голубого цвета, содержащего блеомицин Вз (медьсодержащий хлоргидрат). К элюату добавляют анионообменную смолу "Дау Х". (тидроксильный тип) для доведения рН элюата до 6,0. и элюат фильтруют, растворитель удаляют и высущивает. Получают 12 мг голубого порощка,блеомицина В (медьсодержап,ий хлоргидрат),Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ.лучей, характерный для гли. копептида неполной структуры П, имеет мак., мопоглощения Е ,:59 пои 244 ммкм, лпмак. симум поглощения Е137 при 293 ммкм и концевую адсорбцию в метаноле.Величина, В для полученного соединения состав. ляет 0,66 при тонкослойной хроматографии на силиквгеле (метанол: 10%.ный ацетат аммония: 10%-ная гидроокись аммония - 1 О: 9: 1) и 0,56 при тонкослойной хроматографии на авицеле (н.пропанол: пиридин; уксусная кислота: вода .15: 10: 3: 12), что соответствует у.азаннымвеличинам В для блеомицина Вз, 515461 Продукты гидролитнческого разложения полу.ченных веще с"в следующие: СН - Сг( - СК - СООН Н йй)чНг СН - СН - СООНКНг ЧП зо МН-СНд-СН -СН -СН -К Н - С - )ЧН 50 Таблица 1 Антимикробная активность по отношению к микЗ 5 роорганизму МусоЬасегпзе 607, определяемая почашечному методу (активность стандартного блео.мицина Аз - основания принимается эа 1000 и/мг),составляет 2720 ед/мг,Сравнение стойкости полученного блеоми.4 О пина Вз и исходного флеомицина О, в кислойсреде приведено в табл. 1.1,0 мг полученного блеомицина В 2 и такое жеколичество флеомицина О, растворяют в 10 мл0,01 н,раствора соляной кислоты, и полученный45 раствор выдерживают в кислой среде (рН 2) прио27 С в течение часа. Определяют остаточную антимикробную активность на МусоЬастег)пгп 607 почашечному методу (выражена в расчете на 00 ч.первоначальноч антимикробной активности) .рименецием римера 1. В мини 4 э М стаи. ый блеццои О,5П р и м е р 2. 20 мг порошкообразного флеомицина Е (медьсодержащий хлоргидрат) с максимумом поглощения Е 154 пи1 /о1 смо 244 ммкм, другим максимумом поглощения Е1 ем 57 при 300 ммкм и концевым поглощением УФ. части спектра в метаноле окисляют по методике примера 1, и полученный продукт выделяют хрома. тографией с применением ТМСефадекса С"в соответствии с методикой примера 1. В результате непрореагировавший флеомицин Е элюируют во фракции, элюированной 0,60 М раствором хлористого натрия, а полученный блеомицин В 4 элюи. руют во фракции, элюированной 0,64 М раствором хлористого натрия.В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатывают активным углем, уда. ляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют. Продукт высушивают и получают 10 мг голубого порошка блеомицица В 4 (медьсодержа. щий хлоргидрат). Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ.лучей, ха. рцстерный для гликопептида неполной структу. ры Т, и имеет максимум поглощения Е 162 присм 244 ммкм, другой максимум поглощения Есм при 293 ммкм и концевое поглощение в метаноле.Величина В для тонкослойцой хроматографии на силикагеле (метанол: 10%-ный ацетат аммония ; 10 с.ная гидроокись аммония . 1 О:9:1) составляет 0,50, а для тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол; пиридин: уксусная кислота: :вода=15:1 О:3:12) 0,54.Антимикробцая активносгь на МусоЬастегОго 607, определяемая по чашечному методу (актив. ность стандартного свободного основания блеомицина А 2 принимается эа 1000 и/мг), составляет 6354 и/мг. Сравнение стойкости полученного блеомицина В 4 и исходного флеомицина О 4 в кислой среде приведено в табл, 2. П р и м е р 3. 20 мг поро 1флеомицина О, (це содержащий медьс максимумом поглощения ЕС 9244 ммкм, другим лаксимумом погло56 при 300 ммкм и концевым поглочасти спектра в метаноле, содержаокисляют цо меюдике примера 1 ипродукт вьщеляют хроматографией с иТМ - Сефадекс С" цо мегодцкерезульта ге цепрореагировавший флеэлюцруют во фрака,и, элюироцаццойвором хлохцс 1 оо царця, а полученоциц В 2 элюируют во фракции, глюиров; раствором хлористого натрия. В соответствии сметодикой примера 1 последнюю фракцию обрабатывают акпязныл 1 углем, удаляют соли, растворнейтрализуют и растворитель удаляют, Продуктвысушивают и получают 9 мг бесцветного порошка5блеомицина В 2 (хлоргидрат, не содержащий медь).Полученное соединение ил 1 еег специфическийспектр поглощения Уф-лучей, характерцый для гликопептида неполной структуры Г, и имеет макси.тс,мум поглощения Е .61 при 244 ммкм, другой1 1 /амаксимум поглощения Е127 при 293 ммкм исмконцевое поглощение в метаноле (содержит суль.фат мели) . Величина В для тонкослойной хроматографии ца силикагеле (метанол: 10 -ный ацетатал 1 мония: 10 с-цая гидроокись аммония - 10:9:1)составляет 0,61, а для тонкослойной хромато-графин ца авццеле (ц.пропанол: пиридин: уксусная кислота: вода = 15:10:3:12) - 0,48.Антимцкробцая активность на МусоЬастегцгп607, определяелтая почашечному методу (актив.ность стандартного свободного основания блеомицица А 2 принимается за 1000 ед/мг), составляет2680 ед/мг,П р и м е р 4, 20 мг порошкообразцогофлеомицица01 (медьсодержащцй хлоргидрат),аимеющего максимум поглогцения Е 147 присм 1,о244 ммкм, другой максимум поглощения Е 541 смпри 300 ммкм и концевое поглощение Уф.частиспектра в метаноле, и 20 мг феррицианида калия: растворяют в 1 мл воды и осуществляют реакциюпри комнатной температуре в течение 48 час.После реакции реакционную смесь пропускаютчерез колонну, заполненную 30 мл ТМ-СефадексаС.25", предварительно обработанной 0,05 М раство.ром хлористого натрия. Феррициацид калия и продукт его реакции проходят через колонну, флеомц.цыц и продукт его реакшш адсорбируются с образо.ванием голубой полосы ца верхней части колонны.Концентрацию раствора хлористого натрия в качестве элюата повышают линейно от 0,05 до 1,0 Мпри элюировациц продукта реакции. В результатенепрореагировавшцй флеомициц 01 элюцруют вофракции, элюировацной 0,40 М раствором хлористого натрия, а продукт реакции - блеомицин В 2 -45 элюируют во фракции, элюированцой 0;44 М раст"вором хлористого натрия,В соответствии с методикой примерапослед.нюю фракцию обрабатьва 1 от активным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют ц растворительудаляют. Продукт высушивают и получают 6 мгголубого порошка блеомицица В 2 (медьсодержа.щий хлоргидрат) . Полученное соедцнепе имеетспецифический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для глцкопептида неполной структу 0ры Т, и имеет максимум поглощения Е 156 присм244 ммкм, другой максимум поглощения Е, 124смпри 293 ммкм ц концевое ноглощепе в метаноле.Величина В полученного соединения дчя тоц.кослойцой хромаэографиц на силикаеле (л 1 еацол.10 %-цьШ ацетат аллцгцця: 10 Я-цая гид 1 оокись1Величины В для тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол: пиридин: уксусная кислота; вода = 15; 10; 3, 12) составляют 0,56 для дегидрированного компонента Х и 0,66 для дегид. рированного компонента т,Антимикробная активность по отношению к МусоЬастепцв 607, определяемая по чашечному методу, составляет 2665 ед/мг для дегидрированного компонента Х и 1848 ед/мг для дегидрированного компонента г. В продукте гидролиза дегидрированных компонентов Х и г соединения "УА.56" найдена аминокислота формулы уй, а также на. блюдается положительная реакция на нингидрин, характерная для "УА", что видно из результатов двух бумажных хроматограмм,Стойкость соединений, определяемая по мето. дике примера 1, приведена в табл. 3. Таблица 3 0 Дегидрокомпонент ХДегидрокомпонент тКомпонент ХКомпонент У 100 100 100 ормула изо ни 1, Способ получения стойких гликопелтидныхантибиотиков неполной структуры от лича ющ ий с ятем, что проводяток ение не.лной стук. о антибиотика непо икого гликопепт со-юн-снГсн, - ф4с последующим выделением цеизвестными приемами.2, Способ по п,1, о т л и ч а юпроцесс осуществляют при 0-50 С.3, Способ по п.1, о т л и ч а ю щв качестве окислителя используюкалия или двуокись марганца.4. Способ по п,1, о т л и ч а юв качестве исходного продукта исщенную смесь, содержащую соеструктуры И5. Способ по п.1, от лича юшв качестве соединений неполнойи (Уиспользуют флеомицин, УАи зар левого про йся тем иися тем, что т феррицианид ийс м, что еочи- лной пользуют динения непиися тем, формулыбамицин. аммония = 10 : 9 : 1) составляет 0,66, а для, тонкослойной хроматографии на авицеле (н.пропа. нол; пиридин: уксусная кислота: вода = 15: 10: 3: 12) - 0,56.П р и м е р 5. 100 мг соединения "УА" (медьсо держащий хлоргидрат), состоящего из 70 мг компонента Химеющего максимум погло. щения Е 126,6 при 246,5 ммкм, другой макси. 1/о 1 СМ ф о мум поглощения Е45,6 при 300-303 ммкм и1 см концевое поглощенйе, и из 30 мг компонента г,ьЪ имеющего максимум поглощения Е 134 при1 см 245,5 ммкм и концевое поглощение в метаноле, растворяют в дистиллированной воде и доводят рН до 7,5 добавлением 1 н.раствора бикарбоната нат. рия. 15К раствору добавляют 20 г порошкообраэной двуокиси марганца, и полученную смесь переме. шивают при 5.8 С в течение 9 дней, а затем фильтруют для удаления двуокиси марганца, Фильтрат концентрируют под вакуумом и высушивают, Получают 96 мг неочищенного порошка.Продукт растворяют в 0,05 н.растворе соляной кислоты и выдерживают при комнатной темпера. туре в течение 16 час, подщелачивают до рН 6,0 добавлением раствора гидроокиси натрия и адсор- р 5 бируют на колонне, заполненной 100 мл "СМ.Сефадекса С.25" (натриевый тип).Концентрацию раствора хлористого натрия в качестве элюата повышают от 0,05 до 1,0 М при элюировании продукта реакции с использованием ЗО 1 л раствора хлористого натрия, Дегидрированный компонент 1 элюируют во фракции, элюированной 0,32 М раствором хлористого натрия, а компонент Х - во фракции, элюированной 0,38 М раствором хлористого натрия. Непрореагировавший компо. З 5 кентэлюируют во фракции, элюированной 6,44 М раствором хлористого натрия, а непрореагировав. ший компонент Х - во фракции, элюировд" и 0,48 М раствором хлористого натрия,В соответствии с методикой пРимеРа 1 нолУчен. 40 оный продукт обрабатывают активным углем, уда. ляют соли, раствор нейтрализуют и растворйтель, удаляют, Продукт высушивают и получают 32 мг фиолетово-голубого порошка дегидрированного компонента Х соединения "УА" и 12 мг дегидри рованного компонента У соединения "УА.56".Полученный дегидрированный компонент Х имеет спектр УФ - поглощения с максимумами1 ф/о поглощения Е,см 153 при 243 ммкм и Е 1 116 при1 см 293 ммкм в метаноле.50Полученный дегидрированный компонент т имеет спектр УФ . поглощения с максимумами поглощения Е 152 при 242 ммкм и Е 117 1 /о 1 о1 см при 292 ммкм.Величины й для тонкослойной хроматографии 55 на силикагеле (метанол; 10 о ный ацетат аммония;10 о-ная гидроокись аммония = 10: 9: 1) составляют 0,68 для дегидрированного компонента Х соединения "УА" и 0,71 для дегидрированного качиоиента 1 соединения "УА".ЬО